北畜会報
4
1:9
4
9
7,1
9
9
9
鶏の筋細胞におけるユビキチン局在の組織化学的検討
関川
三男・山本みわこ・島田謙一郎・三上正幸・福島道広・石川稔矩*
帯広畜産大学生物資源科学科,帯広市 0
8
0
8
5
5
5
*日本大学松戸歯学部生物学研究室,松戸市 2
7
1
0
0
6
1
D
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m
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n
s
t
r
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no
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b
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c
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m
i
c
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ls
t
u
d
y
M.SEKIKA
WA,M. YAMAMOTO,K
.SHIMADA,
M. MIKAMI,
M.FUKUSHIMAa
ndT
.ISHIKAWA*
Departmento
fB
i
o
r
e
s
o
u
r
c
eS
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i
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c
e,O
b
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5
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y,NihonU
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o
lo
fD
e
n
t
i
s
t
r
ya
tMatsudo,Matsudo2
7
1
0
0
6
1
キーワード:ユビキチン,鶏肉,熟成,免疫組織化学
K
e
yw
o
r
d
s:u
b
i
q
u
i
t
i
n,c
h
i
c
k
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nm
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d
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i
n
g,i
m
m
u
n
o
h
i
s
t
o
c
h
e
m
i
s
t
r
y
要
の関与など,ほとんど研究されていない.また,ユビ
事
句
キチンは筋細胞や赤血球など身体を構成するほとんど
鶏骨格筋の筋細胞におけるユビキチンの局在を組織
全ての細胞に存在するため,筋柴画分で確認されたユ
化学的に検討した.屠殺直後および熟成させた浅胸筋
Sekikawa e
ta
l
.,1
9
9
8
),筋細胞由来で
ピキチンが (
を抗ユビキチン抗体を用いて免疫染色を行った.凍結
あることを組織化学的に確認する必要がある.そこで
切片の作成に先だって加熱処理を行うと,ユビキチン
本実験では,屠殺後の筋細胞におけるユビキチンの局
の染色性が向上した.熟成が完了した試料においても
在を組織化学的に検討することを目的とした.
屠殺直後と同様の局在が認められた.これらの結果か
材料および方法
ら鶏骨格筋筋築画分で電気泳動的に確認されたユビ
キチンは,筋細胞に本来的に存在し,さらに熟成後の
屠殺した鶏の浅胸筋からユビキチンを電気泳動的に
試料でも加熱処理によって組織化学的に検出し得るこ
確認するための筋疑画分を調製した.筋疑画分を調製
とが示唆された.
するに当たり,爽雑タンパク質の除去およびプロテ
緒
アーゼの失活を目的として加熱処理を行った.すなわ
C
:
:
I
ち,屠殺直後 (
3
0分以内)および冷蔵 (
4C, 6時間)
0
ユピキチンは,原核生物から人まであらゆる細胞に
した浅胸筋を細切し,この 2倍重量の沸騰させた蒸留
存在する分子量 8,
6
0
0,アミノ酸 7
6残基からなるタン
水に懸濁し,
パク質で,その一次構造は進化的に高く保存されてい
C,6,
0
0
0Xg,3
0分間)
これを均質化し,遠心分離(0o
る.ユビキチンの生体内での役割は,主に分解すべき
を行い,上澄液を j
慮過した後,蒸留水に対し透析し,
5分間加熱した後,室温まで放冷した.
タンパク質に結合し細胞内タンパク質分解系の一つで
内液を凍結乾燥した.得られた凍結乾燥品を筋築画分
あるプロテアソーム系へ提示・認識させるマーカーと
とし,これを既報 (
Sekikawae
ta
l
.,1
9
9
8
) に従い電
しての特性や細胞周期の制御あるいは熱ストレスへの
気泳動,ニトロセルロース膜への転写およぴ免疫染色
Fange
ta
l
.,1
9
9
5;田中
抵抗などが挙げられている (
を行った.なお,電気泳動の試料は筋衆画分 5mg/ml
ら
, 1
9
9
6
)
.
の濃度とし,各レーンには 5μlを添加した.免疫染色
筋細胞においてもユビキチンは存在し,飢餓や無重
は,一次抗体としてユビキチン抗血清 (
S
i
g
m
a
)を,二
力など特殊な状況下で筋原線維を分解することが報告
次抗体としてペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギ IgG
T
a
i
l
l
a
n
d
i
e
re
tαl
.,1
9
9
6
)
. しかし,家畜
されている (
(BIO-RAD) を用いた.
を屠殺してから得られる食肉に関しては,ユビキチン
浅胸筋の凍結切片は,筋築画分と同様に屠殺直後お
の存否あるいは役割,プロテアソームーユビキチン系
よび冷蔵(4o
C, 2
4時間)したものから作成した.ユ
ビキチンの染色性と加熱温度との関係を明らかにする
受理
1
9
9
9年 2月 2
2日
ため加熱条件の検討を行った.加熱処理は,約 7mm
-94-
鶏筋細胞のユピキチンの局在
の厚さに切った試料を酸素不透過性フィルムで密封
で比較したもので,差は主に細胞間隙で、認められた.
5,7
5および 8
5Cに設定した恒温槽に入れ
し,これを 6
すなわち,加熱により細胞の外形が規則性を失い,さ
試料の内部温度が設定温度に達してから 5分間保持し
らに細胞間隙が拡大していた. しかし,これに比べ細
0
た.これを水道水で冷却後,開封し約 5mm角に切り
胞内では,加熱処理による影響が少なく,特に核の染
出し?液体窒素で凍結し, 7μmの凍結連続切片を作成
色性は未処理と同様で、あった. NADH-TR染色では,
ematoxylin-E
o
s
i
n(HE)染色, G
o
m
o
r
i
'
s
した.これを H
t
r
i
c
h
r
o
m
e,鍍銀染色, NADH-tetrazoliumr
e
d
u
c
t
a
s
e
(NADH-TR)染色に供し観察した.また,ユピキチン
o
m
o
r
i
'
s
加熱処理を行うと染色性が著しく低下し, G
に対する免疫染色は,一次抗体としてユビキチン抗血
観察きれた.鍍銀染色では加熱処理によって細胞膜の
清(
S
i
g
m
a
)を用い, a
v
i
d
i
n
b
i
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t
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np
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r
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x
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d
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ecomplex
method(ABC法) (
V
e
c
t
a
s
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a
i
nABCK
i
t,V
e
c
t
o
r社)
崩壊像が観察された(光顕像省略).
で発色させ光学顕微鏡で観察した.
t
r
i
c
h
r
o
m
e染色では加熱処理により細胞周辺部で変性
タンパク質に由来すると考えられる赤紫色の染色体が
図 3は,屠殺 6時間後の試料における抗ユビキチン
血清による免疫染色像で,加熱処理により細胞質に頼
粒状の構造が明瞭となり,さらに温度が高くなるにつ
結 果
れてこれらの染色強度が増大する傾向が認められた
図 1は,今回,調製した筋築画分を SDS-PAGEに供
(
a-d). また,図 4は,屠殺後 2
4時間目の試料(加熱
0B染色 (A)および
し,転写膜上でアミドブラック 1
5C)の免疫染色像で,屠殺 6時間後のものに比
温度 7
抗ユビキチン血清による免疫染色 (B) を行った結果
べ核の染色性は低下しているが,細胞質の頼粒状の染
である.個体間での差は少なかったので代表例を示し
色像は屠殺 6時間後のものと同様の特徴を示した.
0
た.すなわち,アミドフゃッラク染色像では屠殺直後 (
3
0
考 察
分)から 6時間目にかけて 1
7kDa以下のバンドの染
色性が強くなった.また,免疫染色像で、はユビキチン
食肉の熟成に伴い細胞質(筋疑画分)の遊離アミノ
に相当するバンドが屠殺後の時間経過にかかわらずに
酸や低分子量のペプチドが増加することは多くの報告
6時間目のものは染色性が低下した.
図 2は,加熱の有無による組織への影響を HE染色
認められたが,
F
i
e
l
de
ta
l
.,1
9
7
1
;Mikamie
ta
l
.,1
9
9
4
),
で一致し (
図 1)の結果
この傾向は,今回,示した SDS-PAGE(
4E d
7sn
・
・
・
・
-4
守噌圃
a b
c .
d
e
J
宮
図 1 筋繋画分におけるユビキチンの同定
屠 殺 直 後 (c, f) および 6時間後 (d, g) の浅
胸筋から調製した筋禁固分 25μgを 15%SDS-PAGE
で分離し,ニトロセルロース膜へ転写した後,アミド
0Bによる染色像 (a- d)および、抗ユビキ
ブラック 1
) を示す. aは分
チン血清による免疫染色像 (e- f
子量マーカー, bおよび eはユビキチンを示す.
-95-
図 2 屠殺 6時間後の鶏浅胸筋の HE染色像
a 非加熱, b 加熱処理 (
7
5C
)
スケールバーは 100μmを示す
0
関川三男・山本みわこ・島田謙一郎・三上正幸・福島道広・石川稔矩
図 3 ユビキチンの染色性におよぼす加熱処理の影響
a 非加熱, b 加熱 6
5C, C 加熱 7
5C, d:加熱 8
5C
スケーノレバーは 50μmを示す
0
0
0
ユビキチンは生体のほとんどの細胞に存在し,細胞
内のタンパク質分解や細胞分裂の制御あるいはストレ
ス抵抗性等の機能が知られている.細胞内において寿
命の短いタンパク質や異常タンパク質は,選択的にプ
ロテアソーム系で分解されるが,ユビキチンはその標
識として機能している.また,ユビキチン自体はスト
レスタンパク質の一種で,熱ショックにより誘導され
Fange
ta
l
.,1
9
9
5
;山尾, 1
9
9
7
)
. さらに,ユビ
る (
キチンは生体における反応ばかりではなく個体死直後
に外界からの強い熱刺激(高温,低温)や虚血などに
Fange
ta
l
.,1
9
9
5;
よっても細胞質や核に誘導される (
図 4 屠殺 2
4時間後の抗ユビキチン血清による
免疫染色像
5C
加熱処理 7
スケールパーは 100μmを示す
0
Shimizue
tαl
.,1
9
9
7
)
. しかし,死後の時間経過に伴
い熱刺激が加えられてもユビキチンは発現しないこと
が示されている(池田ら, 1
9
9
2
)
.牛骨格筋においても,
4時間後に調製した筋紫画分で、ユビ
屠殺直後および 2
0日間の冷蔵により消失す
キチンが確認され,その後 1
ミオグロビンに相当
Sekikawae
tαl
.,1
9
9
8
)
.
ることが示唆されている (
する 17kDa以下のバンドの経時的増加が認められる
今回の結果においても,屠殺直後および 6時間冷蔵し
からも明らかである.すなわち,
(
図 1).この増加は,主にカルパインやカテプシンあ
た鶏骨格筋の筋築画分にユビキチンを電気泳動的に確
るいはアミノぺプチダーゼ等のタンパク質分解酵素に
認できた(図 1).すなわち,鶏肉および牛肉において
E
t
h
e
r
i
n
g
t
o
ne
ta
l
.,
よるものと考えられているが (
,1
9
9
4;Koohmaraie,1
9
9
4;S
e
k
i
k
1
9
9
0;D
r
a
n
s
f
i
e
l
d
ta
l
.,1
9
9
8
),近年,これらの酵素以外に細胞内
awae
屠殺後数時間は,筋疑画分にユビキチンが存在するも
タンパク質分解系としてプロテアソームーユビキチン
系が注目されている.この系は,飢餓や無重力状態で
0
する.一般に,筋肉内の血液は屠殺時の放血で 8
90%除去されるが, 10-20%は残存する.このため均
T
a
i
l
l
a
n
筋原線維を分解することが報告されている (
質化された筋試料には必ず血液由来の成分が混入する
d
i
e
re
tαl
.,1
9
9
6
)
.
と考えられ,電気泳動的に確認されたユビキチンが血
のと考えられる.
ユビキチンは筋細胞ばかりではなく赤血球にも存在
96-
鶏筋細胞のユビキチンの局在
液由来の可能性も推定される.そこで,凍結切片を作
D,Landc
a
l
p
a
i
n
s
)l
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l
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P
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t
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i
n
a
s
e(
c
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t
h
e
p
s
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nB,
成し抗ユビキチン抗体を用いた免疫染色を行い,筋疑
and c
o
n
d
i
t
i
o
n
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n
gr
a
t
e
si
n normal,e
l
e
c
t
r
i
c
a
l
l
y
画分で確認されたユビキチンが,筋細胞由来であるこ
s
t
i
m
u
l
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e
dandh
i
g
h
u
l
t
i
m
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Hchickenm
u
s
c
l
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.
とを確認するために組織化学的観察を行った.その結
8
:9
9
1
0
9
.
MeatS
c
i
.,2
果,筋細胞の凍結切片上で陽性反応が認められたが,
加熱処理を行わなかったものの染色性は著しく低かっ
.H.,TIAO,G
.,JAMES,H.,OLGE,C
.,FISCHER,
FANG,C
]
.E
. and HASSELGREN,P
.0
.
(
1
9
9
5
) Burn i
n
j
u
r
y
た(図 3).さらに,染色強度は加熱温度が高くなるに
s
t
i
m
u
l
a
t
e
s m
u
l
t
i
p
l
e p
r
o
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e
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l
y
t
i
c pathways i
n
つれ増加する傾向が認められた.このことは,今回,
n
c
l
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gt
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b
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t
a
l muscle,i
用いたポリクロナール抗体が熱変性を受けたユビキチ
1S
u
r
g
.,1
8
0
:1
6
1
dependentpathway.]
.Am.Col.
ンをより認識し易いこと,あるいは筋細胞内で加熱処
1
7
0
.
理によりユビキチンあるいはその抗原決定部位が露出
FIELD,R
.A
.,RILEY,M.L
.andCHANG,Y
.
(
1
9
7
1
)Free
する頻度が高くなったこと,などの可能性が考えられ
amino a
c
i
d changes i
nd
i
f
f
e
r
e
n
t aged bovine
るが,詳細は不明で、ある.
muscleandt
h
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rr
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l
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n
s
h
i
pt
os
h
e
a
rv
a
l
u
e
s
.]
.
1
9
9
2
) は,法医学的見地からラットの肝臓
池田ら (
5
0C) すると免疫
および腎臓を摘出し,直ちに加温 (
0
6
:6
1
1
6
1
2
.
FoodS
c
i
.,3
池田卓也,大谷静治,渡漣俊文,舟山真人,森田匡彦
組織化学的にユビキチンが細胞核に認められるが,加
(
1
9
9
2
)熱ショック蛋白質ユピキチンの核内発現に関
0分以上臓器を室
温を 1時間以上継続したり摘出後 2
する実験的研究,法医学の実際と研究, 3
5:8
1
8
5
.
温に放置すると検出不能となると報告している.この
.
(
1
9
9
4
) Muscle p
r
o
t
e
i
n
a
s
e
s and
KOOHMARAIE, M
ことは,個体死直後に組織への血液供給は止まるが,
6
:9
3
1
0
4
.
meata
g
i
n
g
.MeatS
c
i
.,3
個々の細胞は,まだ生体における機能,すなわち熱刺
松本昌泰,北川一夫,鎌田武信 (
1
9
9
4
) 虚血とシャペ
激に対する反応系を保持していることを示唆する.今
0分以内に調製し,屠殺直後にユピ
回,試料は断頭後 3
4
6
8
5
4
.
ロ ン , 蛋 白 質 核 酸 酵 素 , 39:8
MIKAMI,M.,NAGAO,M.,SEKIKAWA,M.,MIURA,H.
キチンの存在を電気泳動的にも組織化学的にも確認す
andHONGO,Y
.
(
1
9
9
4
)E
f
f
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c
t
so
fe
l
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c
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r
i
c
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ls
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m
u
l
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-
ることができた.これは細胞内で、ユビキチンが誘導き
t
i
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nont
h
ep
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p
t
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eandf
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e
eaminoa
c
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dc
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t
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n
t
s
4時
れた可能性も考えられるが,熟成完了後(屠殺後 2
o
fb
e
e
fhomogenateandsarcoplasmad
u
r
i
n
gs
t
o
r
-
間,図 4)の試料においても,屠殺直後と同様の染色
,
.
16
5
:1
0
3
4
1
0
4
3
.
a
g
e
.]
.Anim.S
c
i
.Techno
像が得られており,屠殺あるいは加熱などの刺激で誘
SEKIKA
WA,M.,SENO,K
.,and MIKAMI,M
.
(
1
9
9
8
)
導されたものばかりではなく生体において恒常的に維
Degradationo
fu
b
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ni
nb
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u
r
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gs
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o
r
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g
e
.
持されていたものと推定される.
8
:2
0
1
2
0
4
.
MeatS
c
i
.,4
謝
.,SIONO,H.,FUKUYAMA,T
.
SHIMIZU,M.,OHTANI,S
辞
.
(
1
9
9
7
)Expressiono
fu
b
i
q
u
i
t
i
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n
andSASAKI,M
帯広畜産大学獣医学科病理学教室の松井高峯教授お
eachorgana
tdeathfromhypothermia.]
.F
o
r
e
n
-
よび古岡秀文助教授には免疫組織化学的手法をご教授
s
i
cS
c
i
.I
n
t
e
r
n
a
t
.,8
6
:6
1
6
8
.
頂いた.また,同大学家畜管理学科家畜育種学増殖学
TAILLANDIER,D
.,AUROUSSEAU,E
.,MEYNIAL-DENIS,
講座の三好俊三教授および中札内農協の松崎末太郎氏
D
.,BECHET,D
.,FERRARA,M.,COTTIN,P
.,DUCAS-
には鶏をご供与頂いた.ここに記して深謝する.なお,
TAING,A
.,BIGRAD,X
.,GUEZENNEC,c
.
, SCHMID,H.
:1
0
6
6
0
2
5
3
)
本研究の一部は文部省科学研究費 (MS:件
.
(
1
9
9
6
) Coordinate a
c
t
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v
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t
i
o
no
f
and ATTAIX,D
によった.
a
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d and ATP-ubiquitinlysosomal,Ca2+dependent p
r
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i
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e unweighted r
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文 献
DRANSFIELD,
E
.
(
1
9
9
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)O
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n,
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sm
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l
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.Biochem.J
.,3
1
6
:6
5
7
2
.
田中啓二 (
1
9
9
6
) ユビキチンとプロテアソーム,細胞
5:8
8
8
8
9
6
.
工学, 1
a
g
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gandt
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s
s
.MeatS
c
i
.,3
6
:1
0
5
1
21
.
ETHERINGTON,D
.,
.
] TAYLOR,M.A
.,
.
] WAKEFIELD
,
山尾文明 (
1
9
9
7
) ユビキチンによる翻訳後修飾システ
D
.K
.,COUSINS,A. and DRANSFIELD,E
.(
1
9
9
0
)
-97-
1
3
7
2
1
4
4
.
ム , 蛋 白 質 核 酸 酵 素 , 42:2
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鶏の筋細胞におけるユビキチン局在の組織化学的検討