遺伝子の解析
第1弾 DNAについて&PCR法
遺伝子とは?
DNA(Doexyribo
Nucleic
Acid)
• 2本の鎖がお互いに絡まりあったような構造
• 規則正しく螺旋状になっている構造
• 前に進むにつれて右巻き(時計回り)に回る構造
二重螺旋構造
double helix
1回転(ピッチ)で34Å=10base
ヌクレオシド〔nucleoside〕
とヌクレオチド〔nucleotido〕
二重螺旋構造の各々の鎖はヌクレオチドという
単位の繰り返し(重合)でできています。
アデニン(A)、グアニン(G)というプリン塩基、シトシン(C)、チミン(T)という
ピリミジン塩基にデオキシリボースという五単糖が結合したものをヌクレオシ
ドといい、さらにリン酸が結合したものをヌクレオチドという。
A
5´
4´
3´
2´
糖Sugar
1´
+ P +
T
G
C
ヌクレオシド
=
P
リン酸
Phosphate 塩基Base ヌクレオチドNucleotide
DNAの模式図
P
P
P
P
P
P
3´末端
P
5´末端
水素結合
A
G
A
A
C
T
C
T
C
T
T
G
A
G
5´末端
3´末端
P
P
P
P
P
P
P
DNAについてのまとめ
どこにあるの
か?
何をしているのか?
細胞核(ミトコンドリアにも全DNA量の
約0.1~0.2%を含む)
どのような構造か?
2本のポリヌクレオチド鎖が、A-T、G-Cの
水素結合による塩基対を形成し、10対を
一巻きとする、右巻きの2重らせん構造。
その他
遺伝情報の伝達
1、DNAのA/T比、G/C比はほぼ1。
2、(A+T)/(G+C)の比は生物種により固有。
0.35~2.70の値をとる。ヒトでは1.52、酵母では1.79、大腸菌で
は0.95。
3、DNAの分子量は数百万以上。ヒトでは細胞1個
あたり約5~6pgのDNAを含む。
DNAの変化
• DNAは加熱(通常70℃以上)によりdouble helixがほど
けてランダムコイルになる。これを変性(denaturation)ま
たは融解(melting)という。
• 変性が進むにつれて紫外吸収(260nmの吸光度)が増
大し、完全に変性すると40~50%の吸光度変化が見ら
れる。これを濃色効果(hyperchromic effect)という。
• 50%の変性が起こる温度を融点(Tm:midpoint
temperature)という。水素結合が3対あるG-C結合は、2
対のA-T結合より安定なのでG-C結合が多いほどTmは
高い。
• 変性したDNA溶液を冷却すると、相補的な鎖はひとりで
に結合して元の2本鎖に戻る。これをアニーリング(焼きな
まし)という。
PCR(Polymerase chane reaction)法
PCR法と
は?
ステップ1(Denaturation:熱変性)、ステップ2( annealing:焼きなま
し)、ステップ3(Extension:伸長反応)の3ステップを1つのサイクルと
して1つのテンプレート(鋳型)DNAから2つの複製を作り出し、この反
応を何サイクルも行うことでDNAを指数関数的に大量に増幅させる方
法
指数増幅期
サイクル数
プライマー
5´
スタート時
0
1個=2 個 1サイクル終了時 2サイクル終了時
1
2
2個=2 個
4個=2 個
Ex)
25
25サイクル行うと2 個
・・
・
・・ ・・ ・・ ・・・
PCR産物の増幅
nサイクル終了時
n
2 個
33,554,432個
PCRの各ステップについて
ステップ1(熱変性:denaturation)
まず93~95℃に加熱することにより二本鎖になっている、テン
プレート(鋳型)となるDNAを引き離しプライマー(DNAを酵
素的に合成する際に使われる20~30塩基対の短いDN
A断片。 増やしたい部分の両端に結合する塩基配列を持
つ。)がテンプレートに結合できるような状況をつくる。
テンプレートDNA
5´
3´
3´
5´
テンプレートDNA
5´
3´
3´
5´
加熱(93~9
5℃)
5´
3´
3´
5´
5´
3´
3´
5´
ステップ2(アニーリング: annealing)
それぞれの一本鎖の相補的な部分にプライマーが二本鎖を形成
できる(annealing)温度まで冷却し、伸長反応が起こるようにする。
3´
5´
5´
3´
3´
3´
5´
プライマー
5´
冷却(50~60℃)
5´
3´
3´
5´
5´
3´
プライマー
3´
5´
冷却(50~60℃)
3´
5´
3´
G
G
T G C
C
C
A
C
C
C
G G G T C
A
T A
ステップ3(伸長反応: Extension )
プライマーを起点として耐熱性DNAポリメラーゼ酵素により5´
から3´方向にDNA合成が起こり、DNAの2本鎖が作られる。
耐熱性DNAポリメラーゼ
完成
DNA
鎖の伸長反応
(5´→3´へ向かう)
プライマー
P
OH
P
P
5´末端
3´末端
G
A
A
C
T
DNAポリメラーゼにより次のTに相補的な
P
が選ばれ、3´末端の-OH基が
5´末端のリン酸基とホスホジエステル結
G
合する
T
T
A
3´末端
新しくできた部分
P
P
テンプレートDNA
P
P
P
OH
P
P
P
5´末端
A
G
A
A
T
C
T
T
G
3´末端
P
P
P
P
PCR法の臨床応用
•
•
•
•
結核菌、その他の細菌検査
HCV核酸定性、定量検査
ミトコンドリア病の診断
非侵襲的出生前診断(母体血中を循環し
ている胎児細胞を用いる)
• 染色体異数診断
などなど・・・・・・
参考文献など
改訂 遺伝子工学実験ノート(羊土社) 改訂第2版 生化学ガイドブック(南江堂)
遺伝子の部屋 http://web.wtez.net/n/s/ns54007/gene/gene_main.html
DNAシークエンス
(ABI PRISM310を用いて遺伝子の配列を読む)
原理
オートシークエンサー(ABI PRISM310)のための反応では合成さ
れるDNAを蛍光物質で標識します。このDNAを電気泳動し、泳動中
にレーザー光を当て励起光を自動で検出し、コンピューターで解析し
ます。
ABI PRISM310について
ABI PRISM310でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法
とよばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞ
れに、励起する波長が異なる4種類の蛍光色素をddNTPにつける
方法(Dye Terminator法)を用い、その標識されたDNAフラグメント
を内径50μmのキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそ
れぞれの蛍光をCCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができる。
ダウンロード

DNAシークエンス1