海洋生命・分子工学基礎実験
タンパク質の取扱い
(2)
細胞分子工学研究室担当
2. タンパク質の定量
タンパク質の定量
• Lowry 法によりタンパク質を定量する。
• 濃度のわかっているタンパク(ウシ血清アル
ブミン,bovine serum albumin = BSA)を標
準タンパクとして使用する。
• アフィニティークロマトグラフィーで精製したタ
ンパク質試料3 を定量する。
実験方法
• 試薬 A (1% CuSO4)と試薬 B (2% 酒石酸カ
リウム) をそれぞれ 50 ml,正確に取り,空の
50 ml チューブに入れ,よく混ぜる。
• これに試薬 C (2% Na2CO3 in 0.1 N NaOH)
を 5 ml 加える。試薬 C は,あらかじめ正確に
5 ml ずつ入れたチューブを渡すので,これを
全量使うこと。
実験方法
• 24 穴マルチウェルプレートの 5 ウェルを使っ
て,標準タンパク質の定量操作を行う。
– 5 個のウェル(A1~A5)に,100,95,90,75,50
ml の蒸留水を入れる。
– それぞれに対して,1 mg/ml のウシ血清アルブミ
ンを 0,5,10,25,50 ml 加えて,よく混ぜる。
– ここまでの操作で,A1~A5 のウェルが 100 ml の
タンパク質水溶液を含むことになる。
・・・これが標準タンパク
実験方法
• 24 穴マルチウェルプレートの 1 ウェルを使って,
濃度未知タンパク質の定量操作を行う。
– 1 個のウェル(C1)に,タンパク質試料(アフィニ
ティークロマトグラフィーで精製した 試料3)を ,
100ml 入れる。
・・・これが濃度未知タンパク
実験方法
• A1~A5 と C1 の各ウェルに,最初につくった
A+B+C の混合液を 500 ml ずつ加え,よく
混ぜる。
• 試薬 D (1 N フェノール試薬)を 50 ml 加えて
よく混ぜる。
→ 丁寧に。
→ でも,できるだけ短時間で作業する!
実験方法
• 24 穴プレートにフタをして,30℃ で 30 分間置
く。
• 分光光度計で,青紫色の吸光度を測定する。
• グラフを作成し,未知試料のタンパク質濃度
を計算によって推定する。
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