LC/MS/MSを用いた環境試料中の農薬分析
兵庫県立公害研究所 中野 武
はじめに
環境庁の内分泌撹乱物質分析マニュアルに指定された
方法を、実際の水質や底質に適用すると、環境濃度レベル
測定には不十分な検出感度と夾雑物による妨害のため、
モニタリング調査自体の限界性を感じる場合がある。
そこで今回は、河川水質、底質のモニタリングを目的
として、ベノミルの分解物であるカーベンダジム(MBC)に
関して、環境濃度レベルが把握できる検出感度と妨害物質
に影響されない選択性を実現するために、ESI法による
LC/MS/MS法を用いたng/Lレベルでの分析法を 検討した
ので報告する。
LC/MS、LC/MS/MSの分析条件
HPLC : HP1100
カラム:Develosil C30-UG-5
移動相:A=アセトニトリル
B=5mM 酢酸アンモニウム
A=40%‐15min‐80%(1min)
流速:0.5mL/min
サンプル注入量:20μL
MS : LCQ
イオン化法:ESI(Positive Mode)
加熱キャピラリー温度:225℃
スプレー電圧:4.5kV
Sheath Gas:70arb
Aux Gas:10arb
MS/MS条件
Precursor Ion:m/z 192
相対コリジョンエネルギー:24%
MS/MSの有用性
環境分析における二つの必要条件
感度(感度の向上)
・四重極型- SIM技術
・イオントラップ型-Full Scan感度の向上
選択性(複雑なマトリックスの除去)
・クロマトグラフィーの分離技術の最適化
・高分解能質量分析計(磁場型)
・タンデムマススペクトロメトリー(MS/MS)による
化学的バックグランドから分析対象物のシグナルを
確認する能力(S/Nの向上)、確実性の向上(プロダクト
イオンによるスペクトル)
MS/MS の原理
Single Stage Mass Spectrum
Isolation Event
MS/MS Mass Spectrum
Collisional
Activation Event
イオントラップによるMS/MS
1. Inject
3. Fragment
2. Isolate
4. Detect
Collision Energyの検討
1.2
m/z160
m/z192
0.8
0.6
1.2
Relative Area
0.4
0.2
m/z160
m/z192
0.18ppm
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
20
0.0
22
24
26
28
30
32
34
36
38
40
Relative Collision Energy(%)
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Relative Collision Energy(%)
1.2
0.017ppm
1.0
Relative Area
Relative Area
1.0
MBC Standard 2ppm
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
20
22
24
26
28
30
32
34
36
Relative Collision Energy(%)
38
40
m/z160
m/z192
MBC標品(2ppm)の分析結果
[M+H]+
192.1
100
100
Full Scan Mass Spectra
Relative Abundance
70
60
58.8
40
30
20
80
20
0
100
NL:3.71E6
MS/MS
m/z 192→160
80
60
193.1
74.1
60
40
40
99.5
10
0
Full Scan
m/z 192
60
80
20
100
120
140
160
180
200
0
m/z
0
1
2
160.3
100
O
80
HN
HN
70
N
60
50
O
40
O
30
HN
HN
+
20
N
192.1
10
0
60
80
100
120
140
m/z
160
3
4
5
6
7
Time (min)
MS/MS Spectra
90
Relative Abundance
Relative Abundance
90
50
NL: 1.96E7
80
180
200
8
9
10
11
12
河川水中における分析例
192.1
100
90
80
Relative Abundance
100
Full Scan
m/z192
80
60
60
50
40
30
20
10
20
0
99.5
58.8
60
80
100
193.1
113.8
120
140
160
180
200
m/z
0
100
MS/MS
m/z160
80
160.3
100
90
60
Relative Abundance
Relative Abundance
40
70
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
80
70
60
50
40
30
12
20
Time (min)
192.2
10
161.6
0
60
80
100
120
m/z
140
160
180
200
底質中における分析例
74.1
192.1
100
90
80
Relative Abundance
100
Full Scan
m/z192
80
60
60
57.9
178.5
50
40
104.6
97.1
30
123.9
20
20
10
0
0
100
60
80
100
120
140
160
180
200
m/z
MS/MS
m/z160
80
160.3
100
90
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Time (min)
8
9
10
11
12
Relative Abundance
Relative Abundance
40
138.2
70
80
70
60
50
40
192.2
30
20
10
0
60
80
100
120
m/z
140
160
180
200
検量線
Y = -176525+3.36667e+007*X R^2 = 1.0000
70000000
定量結果
60000000
Area
50000000
サンプル
面積値
濃度(ppm)
40000000
30000000
20000000
10000000
0
0.0
0.5
1.0
1.5
濃度(ppm)
2.0
河川水
18870118
0.566
底質
14324366
0.431
MS/MS分析
1. 絶対感度低下
1/10
2. 妨害・BG低下
BG 1/100
選択性とS/N比の向上
Br-NP-1EC-10ppm_010215212958#34 RT: 0.90 AV: 1 NL: 7.39E4
T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
297.2
100
Br-NP-1EC-10ppm_010215213122#13 RT: 0.34 AV: 1 NL: 1.10E6
T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
355.0
100
20%
90
85
80
90
85
70
65
65
60
60
Relative Abundance
75
70
55
m/z 355
50
45
O
40
35
Br
30
Br
30%
O
80
75
55
50
45
40
O
35
O
25
m/z 355
30
O
25
20
20
15
15
355.1
Br
O
O
10
10
354.4
5
5
311.3
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
100
1000
200
300
400
500
5E90.3 :LN 1 :VA 33.0 :TR 31# 904312512010_ mpp01-CE1-PN-rB
]00.0001-00.59 [ [email protected] 2 s m lluF c - :T
0.553
001
25%
95
09
90
58
85
08
80
57
75
07
70
56
65
m/z 355
05
O
Br
54
04
O
O
297
2.792
008
007
006
005
004
003
002
001
ecnadnubA evitaleR
55
009
700
800
900
1000
Br-NP-1EC-10ppm_010215212737#21 RT: 0.54 AV: 1 NL: 5.93E4
T: - c Full ms2 [email protected] [ 95.00-1000.00]
297.2
100
59
06
0001
600
m/z
m/z
Relative Abundance
Relative Abundance
297
95
95
40%
297 Br
60
O
55
50
45
40
53
35
03
30
52
25
02
20
51
15
01
10
5
5
0
0
100
200
300
z/ m
MS/MS 分析 (Br-NP-1EC)
400
500
600
m/z
700
800
900
1000
分析例 環境河川水
1.淡路島 三原川 脇田橋 農業地帯
たまねぎ・白菜・米 ベノミル散布
2.加古川市 別府川 十五社橋 都市域
COD有機物汚染 ワースト5 +農業
wakita_03_000712150346
Collision 24%
07/12/00 03:03:46
RT: 0.00 - 20.00 SM : 7G
RT: 6.55
M A : 29461580
Relative Abundance
100
MBC
80
2900万
60
40
NL: 2.05E6
TIC M S
wakita_03_000712150346
ESI MS/MS 192 =>50-200
20
0
RT: 6.55
M A : 25388877
100
MBC
80
2500万
60
40
NL: 1.82E6
m/z= 159.0-161.0 F: + c
ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00] M S
wakita_03_000712150346
ESI MS/MS 192 =>160
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (min)
11
12
13
14
15
16
17
18
19
wakita_03_000712150346#315 RT: 6.22 AV: 1 NL: 4.66E4
F: + c ESI Full ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
160.3
Relative Abundance
100
ESI MS/MS 192 =>50-200
80
60
RT:6.46分
MBC
40
192.2
20
119.0 123.6
172.7
199.9
0
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
m/z
淡路島 三原川 脇田橋
150
160
170
180
190
200
jyugosya_03_000712155625
Collision 24%
07/12/00 03:56:25
RT: 0.00 - 19.98 SM : 7G
A
Relative Abundance
100
RT: 6.46
M A : 25724412
MBC
80
2600万
60
40
NL: 1.87E6
TIC M S
jyugo sya_03_0007121556
25
ESI MS/MS 192 =>50-200
20
0
RT: 6.46
M A : 22919319
100
80
MBC
2300万
60
40
NL: 1.63E6
m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI
Full ms2 [email protected] [
50.00-200.00] M S
jyugo sya_03_0007121556
25
ESI MS/MS 192 =>160
20
0
Relative Abundance
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (min)
11
12
13
14
15
16
ESI MS/MS 192 =>50-200
A
RT:5.25分
9
5
99.0 104.8
0
100
120.8
132.1
17
18
191.2
146.6
160.3
174.3
175.1
172.5
jyugosya_03_000712155625#
266 RT: 5.25 AV: 1 NL:
1.50E5 T: + c ESI Full ms2
[email protected] [ 50.00-200.00]
192.2
192.9
160.3
jyugosya_03_000712155625#
327 RT: 6.46 AV: 1 NL:
1.63E6 F: + c ESI Full ms2
[email protected] [ 50.00-200.00]
MBC RT:6.46分
50
130.9
0
50
60
70
80
90
100
110
120
130
146.2
140
150
159.6
161.6
160
19
192.1
174.0
170
180
m/z
加古川市別府川十五社橋
190
199.8
200
分析例 環境河川底質
1. 淡路島 三原川 脇田橋 農業地帯
2. 加古川市 別府川 十五社橋 都市域
3. 尼崎市 神崎川 辰巳橋
4. 明石市 明石川 嘉栄橋
wakita_03_000712171509
Collision 24%
07/12/00 05:15:09
MBC
RT: 0.00 - 19.99 SM : 7G
A
Relative Abundance
100
80
RT: 6.46
M A : 21489811
NL: 1.63E6
TIC M S
wakita_03_000712171509
ESI MS/MS 192 =>50-200
60
40
20
0
RT: 6.46
A A : 18899343
100
MBC
80
NL: 1.41E6
m/z= 159.0-161.0 F: + c
ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00] M S
wakita_03_000712171509
ESI MS/MS 192 =>160
60
40
20
0
Relative Abundance
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (min)
11
12
13
14
15
16
ESI MS/MS 192 =>50-200
7
4
18
191.2
A
2
17
192.3
100.1
164.1
160.3
0
100
174.1
177.3
133.0 140.9 150.4 159.5 161.5
0
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
m/z
淡路島 三原川 脇田橋
wakita_03_000712171509#2
66 RT: 5.25 AV: 1 NL: 1.10E5
T: + c ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00]
193.3
wakita_03_000712171509#3
27 RT: 6.46 AV: 1 NL: 1.55E6
F: + c ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00]
MBC
50
19
192.1
173.3
170
180
190
199.8
200
jyugosya_03_000712174122
Collision 24%
07/12/00 05:41:22
A
RT: 0.00 - 20.00 SM : 7G
Relative Abundance
100
MBC
RT: 6.56
M A : 4536919
80
NL: 3.15E5
TIC M S
jyugo sya_03_00071217412
2
ESI MS/MS 192 =>50-200
60
40
20
0
NL: 2.26E5
m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI
Full ms2 [email protected] [
50.00-200.00] M S
jyugo sya_03_00071217412
2
RT: 6.54
A A : 3084399
100
MBC
80
60
40
ESI MS/MS 192 =>160
20
0
Relative Abundance
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (min)
11
12
13
14
15
16
ESI MS/MS 192 =>50-200
40
17
18
191.2
jyugosya_03_000712174122#
271 RT: 5.35 AV: 1 NL:
9.45E4 T: + c ESI Full ms2
[email protected] [ 50.00-200.00]
30
A
20
10
114.9
80.6
0
100
123.8
132.4
148.9
173.3
160.2 163.4
160.3
192.3
193.3
jyugosya_03_000712174122#
330 RT: 6.52 AV: 1 NL:
2.39E5 F: + c ESI Full ms2
[email protected] [ 50.00-200.00]
MBC
50
100.3
57.8
0
50
60
70
80
90
100
159.5
110
120
130
140
150
161.5
160
191.3
173.9
170
m/z
加古川市別府川十五社橋
19
180
190
200
Tatsumi_04_000712183407
Collision 24%
07/12/00 06:34:07
B
RT: 0.00 - 20.00 SM : 15G
A
Relative Abundance
100
MBC
RT: 6.46
A A : 2241581
ESI MS/MS 192 =>50-200
80
60
NL: 1.91E5
TIC M S
Tatsumi_04_0007121834
07
40
20
0
RT: 6.46
A A : 1544641
100
MBC
80
NL: 1.08E5
m/z= 159.0-161.0 F: + c ESI
Full ms2 [email protected] [
50.00-200.00] M S
Tatsumi_04_0007121834
07
ESI MS/MS 192 =>160
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Time (min)
11
12
13
14
15
16
17
ESI MS/MS 192 =>50-200
100.0
11
Relative Abundance
5
85.8 91.1
0
30
B
133.2
100.7
100.1
136.0
160.9
194.1
173.6
191.3
91.2
84.2
99.2
100.8
132.3
114.7
147.0 149.2
0
100
50
149.0
158.9
172.7
176.8
192.2
193.3
160.4
MBC
132.8
0
60
80
100
120
160
Tatsumi_04_000712183407#270 RT:
5.33 AV: 1 NL: 4.44E4 T: + c ESI Full
ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
Tatsumi_04_000712183407#327 RT:
6.46 AV: 1 NL: 1.47E5 F: + c ESI Full
ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
161.8 173.3 179.6
140
19
Tatsumi_04_000712183407#213 RT:
4.20 AV: 1 NL: 1.55E4 T: + c ESI Full
ms2 [email protected] [ 50.00-200.00]
191.2
A
18
192.1 199.6
180
m/z
尼崎市 神崎川 辰巳橋
200
D:\0706Benomyl\...\kaei_03_000712141105
Collision 24%
07/12/00 02:11:05
RT: 0.00 - 20.00
A
Relative Abundance
100
6.56
MBC
6.60
80
NL: 9.94E5
TIC M S
kaei_03_000712141105
ESI MS/MS 192 =>50-200
60
40
20
5.37 5.45 6.30
0.58
0
100
1.37 1.95 2.36
3.01
6.78
3.99 4.38
6.56
80
7.85 8.15 8.43 8.86 9.97
10.29 11.22
12.94 13.08
14.90 15.02
16.01 16.13 17.00 18.35 18.39 19.07 19.60
NL: 7.61E5
m/z= 159.0-161.0 F: + c
ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00] M S
kaei_03_000712141105
MBC
ESI MS/MS 192 =>160
60
40
20
6.30
0.88 1.11 1.37 2.06 2.46 3.49 3.73
0
0
Relative Abundance
12.13
1
2
3
4
4.60 4.92 5.89
5
6
7.06 7.32 8.01 8.68 9.04
7
8
9
10.21
11.46 11.75
10
Time (min)
11
12.61 12.94
12
13.95 14.57 15.00 15.90 16.41
13
14
15
16
ESI MS/MS 192 =>50-200
8
17.50
17
191.2
A
4
2
97.2
0
100
18.55
18
132.2 136.2
114.9
149.2
160.1
kaei_03_000712141105#271
RT: 5.35 AV: 1 NL: 5.64E4
T: + c ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00]
192.2
193.0
172.9
160.3
kaei_03_000712141105#330
RT: 6.52 AV: 1 NL: 7.36E5
F: + c ESI Full ms2
[email protected] [
50.00-200.00]
MBC
50
192.1
134.3
110.1
0
50
60
70
80
90
100
110
120
130
150.2 159.4
140
150
161.4
160
19.62
19
173.4
170
187.1
180
m/z
明石市 明石川 嘉栄橋
198.9
190
200
MBCのMS/MSによる開裂パターンの推測
-計算化学へのアプローチー
O
160.3
HN
100
HN
N
90
Relative Abundance
80
70
60
50
O
40
O
30
HN
HN
+
20
N
192.1
10
0
60
80
100
120
140
m/z
160
180
200
メーリングリストによる情報共有
内部標準として添加する標識化合物の情報を
はじめとして、MS分析のノウハウ、失敗の共有
などを進める。
日本水環境学会MS技術研究委員会
[email protected]
ダイオキシン分析
[email protected]
Webサーバーによる情報共有
内分泌かく乱・ダイオキシン最新情報
ダイオキシン国際シンポのabstract翻訳
http://www.ee-net.ne.jp/dioxin2000/share.html
<volume, page no.>
47, 9-12
<English title>
Relative Contribution of Chlorinated Naphthalenes, Biphenyls, Dibenzofurans and Dibenzo-p-Dioxins to Toxic
Equivalents in Biota from the South Coast of the Baltic sea.
<Japanese title>
バルト海南岸生物相のPCN, PCB, PCDD, PCDF、毒性等価量への相対的寄与
<authors>
J. Falandysz, K. Kannan, M. Kawano and C. Rappe
<key words>
TCDD TEQs, Baltic sea , PCN, PCB, PCDD, PCDF, sediment, plankton, mussel, crab, fish, cormorant,
wildlife, seafood
<Japanese key words>
TCDD毒性等価量, バルト海, PCN, PCB, PCDD, PCDF, 底質, プランクトン, イガイ, カニ, 魚, 鵜, 野生動
物, 海産食品
<captions>
Table l. TCDD Equivalents (H4IIE EROD or H4IIE-Luc) of dioxin-like PCBs, PCNs, PCDFs and PCDDs in varioussamples from
the southern of the Baltic Sea(pg/g lipid wt)
Table l. バルト海南部の各種試料中ダイオキシン様のPCBs、PCNs、PCDFs、PCDDsのTCDD毒性当量(H4IIE-ERODまたはH4IIEルシフェラーゼ)(pg/g脂質重量)
<summary>
研究の目的は、バルト海南岸の海産生物のPCN, PCB, PCDD, PCDFにおけるダイオキシン様活性、毒性等価量
への相対的寄与を、提出することである。底質, プランクトン, イガイ, カニ, 魚, 鵜, 野生動物, 海産食
まとめ
MS/MSの効果
マトリックスの影響を抑えたクロマトグラムによるS/Nの向上、
プロダクトイオンによるスペクトルから正確性の向上を図ることができた。
より確実性が高く、高感度の定性、定量が可能。
さらに複雑なマトリックス(食品中など)のサンプルへの
適用が期待できる。
情報の共有
メーリングリスト・Webサーバーの活用
参考文献
1) T.A.Roberts et al, Metabolic Pathways of Agrochemicals,1113-1137
ダウンロード

LC/MS/MSを用いた環境試料中の農薬分析