川崎病病原体としての
化膿レンサ球菌L型菌の検討
-L型菌と野生型ではどちらが多くの
ヒアルロニデースを産生するか-
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【目的】
川崎病の病原体として化膿レンサ球菌L型菌を検討する
。川崎病の病態は溶連菌感染症に似るため、当初から化膿
レンサ球菌は原因菌として検討されたが、患者から本菌や
そのL型菌、抗SLO抗体、抗SK抗体等も検出されないこと
など、現在、否定的見解も多い。
我々は第79回本学会西日本地方学術集会において、L型
菌化した化膿レンサ球菌ではストレプトリジンOとストレ
プトキナーゼを産生しない株(124 L 株)があることを報
告し、川崎病の原因菌として本菌のL型菌を更に検証する
必要があることを指摘した。
そこで今回は、ストレプトリジンOとストレプトキナー
ゼの産生に関しては、124L株の親株124株の結果を追加し
て報告し、更に野生型とL型菌のヒアルロニデース産生量
を比較する。
【方法】
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菌
株
L型菌は124 L株、野生型は124株(帝京大学・西山彌生博士より分与)、
K5866株、K6274株、K6169株(鹿児島大学・西順一郎博士より分与)を用
いた。
ストレプトリジン0とストレプトキナーゼの産生の比較
ストレプトリジン0の溶血反応の観察は2つの方法(①、②)を用いて行っ
た。①はL型菌用液体培地(0.5% yeast extract, 4% NaCl, 10% FBSを加えた
brain heart infusion broth )、②は羊血液寒天培地(日水製薬)に滅菌飽和
食塩水1.5mlを加え(浸透圧調製のため)37℃で乾燥させた培地を用いた。培
養は共に好気と嫌気培養を行い、血液寒天面の溶血帯を調べた。SLO、SK酵
素産生の確認には、全菌体成分に対する、抗SLO抗体(ABS社 HAB
003)を用いたウエスタンブロッティングと抗SK 抗体(ACR社 BP988
)を用いたドットブロッティングを行った。
ヒアルロニデース産生の比較
培養は、L型菌用液体培地(0.5% yeast extract, 4% NaCl, 10% 胎仔ウシ
血清 を加えたbrain heart infusion broth )で静置培養や嫌気培養を37℃で
48時間行った。ヒアルロニデースの産生量の比較は、同一条件下で超音波破
砕した全菌体成分に対する抗hyaluronidase
polyclonal抗体(NOR社
NE076/7S)を用いたウエスタンブッロティングによって行った。
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化膿レンサ球菌の野生型と そのL 型菌
野生型
L 型菌 (124 L
株)
2μm
2μm
L型菌になると細胞は小型化し、培養条件によっては大型化もする。通常大小の細胞が混在し、
buddingによって極微小な顆粒状の細胞も多量につくられる。
L 型菌124 L 株の由来: 82の臨床分離株より13株のL型菌株が作
成され、継代に成功した安定型L型菌株(横浜市大・江田ら、1972年)
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化膿レンサ球菌の L 型菌124 L 株
1μm
0.05 μm~数μmの菌体が見られる
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実験①
化膿レンサ球菌 L 型菌124 L 株の
ストレプトリジンO 産生の確認
ヒト赤血球に対する溶血反応(嫌気培養と好気培養)
L型菌は通常の血液寒天培
地では増殖しない
液体培地でL型菌を増殖させ、
溶血の有無を観察する
血液寒天培地
L型菌用液体培地
6
結果 (嫌気培養)
野 生 型
Control
K5866
124L 株には溶血帯(
L 型 菌
K6169
124 L
)が見られなかった
(好気培養結果も同様)
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結果
回収された菌体と培養液
野 生 型
K5866
K6169
L 型菌
124 L
培養液
菌体
124 L株の増殖を確認、溶血による培地の赤変がなかった
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結果 1 化膿レンサ球菌L型菌124L株の好気培養
による羊血液寒天培地(3.5%NaCl)での溶血反応
a: K6169株,
b: 124P株 ,
c:124L株
菌の増殖が分かる角度で撮影
溶血帯を示す透過光で撮影
a
a
b
c
b
c
好気培養で124L株には溶血帯が見られなかった
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結果 2 化膿レンサ球菌L型菌124L株の嫌気培養
による羊血液寒天培地(3.5%NaCl)での溶血反応
a: K6169株,
b: 124P株 ,
菌の増殖が分かる角度で撮影
a
b
c
c:124L株
溶血帯を示す透過光で撮影
a
b
c
嫌気培養でも124L株には溶血帯が見られなかった
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結果
化膿レンサ球菌L型菌124L株のストレプト
リジンO産生に関するウエスタンブロッティング解析
Anti-streptolysin O mouse monoclonal antibody (1:250希釈)
K6169 124 L
94K・
K6169 124 L
K6169株
124 L
94K・
67K・
67K・
ドット・ブロッティング
ウエスタン・ブロッティング
124L株には抗SLO抗体に反応するバンド、ドットが見られなかった
SDS-PAGE
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結果 化膿レンサ球菌 L 型菌124 L 株のストレプト
キナーゼ産生に関するドットブロティング解析
Anti-streptokinase rabbit polyclonal antibody (1:12000希釈)
野 生 型
K5866 株
K6169 株
L 型 菌
124 L 株
124L株には抗SK抗体に反応するドットが見られなかった
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野生型と L 型菌のヒアルロニダーゼ産生量の比較
Anti-sheep hyalunonidase polyclonal rabbit IgG(NOR)による
ウエスタンブロティング解析
94k
67k
67k
43k
43k
30k
本培養条件ではL型菌の抗ヒアルロニダーゼ抗体に反応す
るバンドは野生型より濃厚であった
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【結果と考察】
ストレプトリジン0産生の比較では、野生型4株には溶血帯と、抗
SLO蛋白に反応するバンドやドットが見られたが、L型菌124L株では、
好気、嫌気培養共に溶血帯が見られず、抗SLO抗体に対する反応も見ら
れなかった。また、抗SK抗体に反応するドットも見られなかった。この
結果から、化膿レンサ球菌がL型菌化すると、これらの酵素を産生しな
い株が出現する可能性が示唆された。
ヒアルロニデースの産生を調べたウエスタンブロッティングの結果で
は、 124L株は、124L株の親株を含む4株の野生型より明瞭に濃厚なバン
ドが見られ、L型菌化すると野生型よりヒアルロニデース産生量が増加す
る可能性が示唆された。
病原細菌がL型菌化すると、一般的に病原性は減弱する傾向がある。
しかし、病原性が弱くなる事によって原因不明の疾患になる可能性もあ
ると考え、その一つとして、川崎病を検討した。今回のL型菌株の様な化
膿レンサ球菌L型菌が原因であるなら、抗SLO 抗体、抗SK抗体が患者か
ら検出されない事も理解され、また、ヒアルロニデースが種々の症状に
関連している可能性もある。川崎病患者組織からは、L型菌様の微生物
も観察されるなど、他にもL型菌が疑われる知見があり、今後、更に川
崎病の病原体としてL型菌を検討する必要があると思われた。
考察
なぜ L 型菌化すると SLO を産生しなくなるか
- L 型菌化した場合のペリプラズム蛋白量の変化-
野生型
ペリプラズム蛋白
完全な細胞壁
ペリプラズム蛋白量
正常値
L 型 菌
不安定型 L 型菌
安定型 L 型菌
不完全な細胞壁
細胞壁なし
やや減少又は
大量に産生される可能性
減少又は消失
L 型菌には細胞壁成分の存在が報告されているものもあり、図の様な状態で漏出によりペリ
プラズム蛋白が過度に産生されたり、細胞壁を完全に失なった場合にはペリプラズム蛋白の
減少や消失が起こるものと考えられる。
参考
川崎病
川崎病で化膿レンサ球菌が否定される点
1.患者検体から、溶連菌も、そのL型菌も分離されない
2.川崎病患者回復期血中のASLO値、ASK値が上昇しない
3.ペニシリン系の抗生剤が無効
川崎病でL型菌が疑われる点
1.グラム陰性菌様、リケッチア様、 L型菌様、と形容され
る微小粒子が、患者の急性期血液、発疹部の皮下組織
冠状動脈瘤部、心筋炎部などに観察(電子顕微鏡)さ
れており、L型菌の細胞表面の形態や、大小の細胞が
ある点などが類似している。
2.ペニシリンが無効である。
3. L 型菌は通常の菌に比べ分離培養が困難である。
川崎病患者から検出された細菌様微小粒子
川崎病川崎病患者 Cater
Caterら、1975
ら、 1976
川崎病患者 Ueno ら、 1983
川崎病
Uenoら、1983
血液
脾臓炎病巣部
川崎病患者 Ueno ら、 1983
川崎病
Uenoら、1983
血液
川崎病患者 濱島ら、 1985
川崎病
濱島ら、1985
発疹部の皮下組織
川崎病
L型菌124L株
(Uenoら 1983)
(江田ら、1979)
細菌様微
小粒子
L型菌
1μm
1μm
川崎病患者の細菌様微小粒子とL型菌は形態的に近似している
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