生化学合同講義(2009年6月3日)
生命科学研究科、山本和生
[email protected]
「突然変異生成の分子機構」
1) 突然変異をどのように把握するか
2) 突然変異とがん
Fileのupload
http://www.biology.tohoku.ac.jp/~kazuo/09seikagaku/
突然変異(mutation)
塩基配列が変化する(広い意味での変化)。
その結果表現型が変化する。
(表現型の変化が子孫(広い意味の子孫)に伝わる)。
表現型の変化しない塩基配列変化はヒトの場合0.1%の頻
度で全員にある(polymorphism)
意義;進化(多様性)・がん・遺伝病
生物は適応的に変異が生じて進化したのではなくて,ラ
ンダムに生じた変異が淘汰されることによって進化した
(非ラマルク説)。
遺伝と遺伝病
遺伝病は遺伝現象を担っているもの(遺伝子や染色
体)の異常によって起こる病気
もし異常が体細胞(手や肝臓などの細胞)に起きた場
合,遺伝病にはなるが遺伝はしない。
もし生殖細胞(精子や卵子になる)に起きた場合,遺
伝する可能性がある。
ヒトは全員,20〜30個の遺伝病をヘテロ接合体
(T/t)の状態で持っている。多くは劣性なので発現
(発病)しない。
genetic disease(遺伝子病)
inheritant disease(遺伝する病気)
遺伝病とは
遺伝病は遺伝という現象を担っているものすなわち
遺伝子や染色体の異常によって起こる病気を言う。
「遺伝病とは遺伝する病気」と言うわけではない。
伝わるとか伝わらないという概念とは違う。
親が正常でも突然変異によって起こる遺伝病もある。
先天異常についていえば,病気の赤ちゃんの多くは,
まったく正常な両親から生まれており,けっして特
別な人がかかわるわけではない
「自分自身が遺伝病に罹患しているかもしれないし,
遺伝病の子が生まれるかもしれない」というのが正
しい理解。
常染色体劣性遺伝病
健康保因者同士の
結婚で,生まれる
子供の4人に1人
が病気になる
劣性遺伝病-1
両親とも保因者で,それぞれ1個は白丸,1個は黒丸を持っている場合,患
者が生まれることがある。どちらから白あるいは黒が伝わるかで,4通り
の組み合わせが出来る。白と白なら正常,白と黒は健康で保因者,黒と黒
なら病気の子となる。すなわち,保因者同士のカップルからは,4人に1
人の割合で病気の子供が生まれる。
算数の問題;ある劣性遺伝病の発生頻度が4万人に1人とす
る。保因者同士のカップルからは,4人に1人の割合で病気
劣性遺伝病は1万人から10万人に一人の割合で起こるもの
の子供が生まれる。保因者は何人に1人か?
が多い。平均して発生頻度が4万人に1人の病気の場合,患
保因者をX人に一人とすると,
者すなわち黒丸二個の人は4万人に1人の割合で生まれるが,
(1/X)2 x (1/4) = 1/40000: この式より,X2 = 10000;
保因者すなわち黒丸1個の人がどれくらいいるかというと,
X = 100
答えは100人に1人である。4万人に1人と大変稀な病気
であっても,保因者の頻度は二桁も高くなる。
Hardy-Weinberg の法則
A
AA
A
a
野生型遺伝子(A)の頻度を p
a
Aa
変異遺伝子(a)の頻度を q (p + q = 1) とする。 Aa
健康保因者(Aa)の頻度について
aa
AA : Aa : aa = p2 : 2pq : q2
ある遺伝病患者が40000人に一人とすると, パネットの方形
aa(遺伝病)の頻度 q2 = 1/40000, q = 1/200
p = 1- q = 1-1/200 = 199/200
Aa(保因者)の頻度 = 2pq = 2 x 199/200 x 1/200
= 199/20000 = 99.5/10000 ≒ 1/100
別の解き方;保因者の頻度をyとすると,保因者同士が結婚
する確率はy2,その結婚から患者が生まれる確率は1/4、以
上より,y2 x 1/4 = 1/40000。この式を解くと,y = 1/100
劣性遺伝病-2
常染色体劣性遺伝病は先天代謝異常症を中心に約2000
種類知られている。すべての疾患の頻度が明らかに
なっているわけではないが,保因者頻度を100人に1人
程度とすると,2000 x 1/100 = 20となり,すべての
人は常染色体劣性遺伝病の病的遺伝子を20個程度持っ
ているということになる。「全てのヒトはみな保因
者」である。
よく,劣性遺伝病の子供が生まれると,親は自分たち
が保因者だったことを重く見て落ち込む人がいるが,
それはたまたま病気の子供が生まれ,1個分の黒丸を
持っていたことがわかっただけで,全ての人は,等し
く20個の遺伝病を持っていることを忘れてはならない。
保因者であることは,恥ずべきことではない。
塩基と大きさ
Purines
Pyrimidines
Adenine
Thymine
Weak
Guanine
Cytosine
Strong
Large
Small
DNAの化学-1
DNAの化学-2
DNA, RNA, thymine, uracil
Uracil
Thymine
5
5
4
1
3
2
2-Deoxyribose
4
1
3
Ribose
2
Nucleotide
3 components to nucleotides:
-Purine(A & G) or pyrimidine(T & C)
base
-Ribose (RNA) or 2-deoxyribose (DNA)
sugar
-Phosphate
Base + sugar = Nucleoside
Base + sugar + phosphate = Nucleotide
リン酸
デオキシリボーズ
塩基
5'
3'
P
3'
OH
5'
T : A
3'
P
5'
P
3'
5'
G : C
・
3'
5'
P
P
5'
C ・: G
3'
3'
5'
P
P
5'
3'
A : T
5'
3'
OH
P
3'
T
5'
P
P
P
P
A
HO
3'
5'
DNAの方向性
について
Dinucleotideの構造
The 3’ C of one
nucleotide is linked
to the 5’ C of the
next nucleotide in
a phosphodiester
linkage.
NH 2
N
O
O P O
O
N
5'
O
CH2
O
NH 2
N
3’3'
O H
O
P O
O
5' cytidylyladenylate
or5’pCpA3’
5'pCpA
5’ N
5'
CH2
O
OH H
3'
N
N
Watson and Crick’s
DNA model
幅は一定
Purine faces
pyrimidine
and
vice-versa
3.4 nm
2 nm
Mutations
Point Mutations -- DNA複製間違い
1. transitions 2. transversions 3. frameshift
mutations 4.deletion
Structural Mutations -- 染色体の組み換え間違
い
1. Deletions 2. Inversions
3.Translocations 4. Duplications
Chromosome Mutations -- 細胞分裂間違い
1. Polyploidy 2. Aneuploidy
transitionとtransversionを総称して
base substitution(塩基置換)という
ピリミジン
ピリミジン
Point Mutations
1. transitions (change from pupu or pypy)
2. transversions (pu ⇔ py)
keto-enol tautomerism
プリン
thermal depurination (10,000
adenines per cell per day)
deamination (cytosine),
oxidation (guanine)
replication error
3. frameshift mutations
アデニン(A)
replication slippage
4. Deletion
ウラシル(U)
チミン(T)
replication slippage
recombination
グアニン(G)
シトシン(C )
Transitionとtransersion
5’-GATCC3’-CTAGG-
-GACCC-CTGGG-
transition
5’-GATCC3’-CTAGG-
-GAGCC-CTCGG-
transversion
Transitionのほうがよく起こる。Transitionや
transversion突然変異生成やそれを抑制する機構
に違いがある。
Transition
tautomeric shift
depurination
Tautomeric Shifts
O
CH3
CH3
C
5
C
C4
N
H
H
6
1
3
C
HO
tautomeric shift
N
2
C
H
C
C
N
N
H
H
C
O
O
thymine
(通常はケト型)
(adenineと対合)
thymine
(まれにエノール型)
(guanineとも対合)
tautomeric shift
アデニン,シトシンのイミノ型へのtautomeric shift 及び
グアニン,チミンのエノール型へのtautomeric shiftはお
およそ10-4〜10-5の頻度で起きている。下はグアニンの例
。
OH
O
HN1
6
5
ここが変わる
8
2
NH2
N
7
3
4
N
ケト型グアニン
(正常型)
9
N
dR
H
N1
6
5
8
2
NH2
N
7
3
N
4
9
H
N
dR
エノール型グアニン
tautomeric shiftの結果,dGはdTと結合できるようになる。
チミンtautomerによる変異
A T-e
G:T-e
normal
G T-e
A T
normal
G C
mutant
突然変異が生じるためには2回の複製を経る。
G:T-e は,mismatchとして修復の対象となる。
tautomeric
shift
GT-e
or
A T
normal
正常塩基及びtautomerの塩基対合の性質
Base
common state
pairs with
rare state pairs with
T
keto(=O)
A
enol (-OH)
G
keto
C
enol
T
A
amino(-NH2)
T
imino(-NH)
C
C
amino
G
imino
All tautomers cause transition mutations
G
A
Depurination: 高頻度に生じる自然損傷
P
P
P
P
P
P
P
P
P
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Pur
Py
Py
Pur
Py
Pur
Pur
Py
Pur
Py
Pur
Pur
Py
Pur
Py
Py
Pur
Py
S
S
S
S
S
S
S
S
S
P
P
P
P
P
P
P
P
P
Pur
P
P
S
S
Pur
Py
Py
Pur
S
S
P
P
depurination
P
P
S
S
Py
Pur
Py
S
S
P
P
P
P
P
P
P
S
S
S
S
S
Py
Pur
Pur
Py
Pur
Pur
Py
Py
Pur
Py
S
S
S
S
S
P
P
P
P
P
Depurination
;塩基と
deoxyribose
(S)の間に切断
が入り,
adenine あるい
はguanine が
DNAから遊離
する。
自然塩基損傷
,高温などが
原因。
frameshift mutations
3. frameshift mutations
main causes
missense repair,
alkylating agents,
oxidative damage
intercalating substances (ethidium
bromide, flavones)
replication slippage
Frameshift (Replication Slippage)
読みとり枠(reading
frame)が変化するよ
うな変異のことを
frameshift mutation
と言う。基本的には
複製エラーで生じる。
Frameshift mutation and diseases-1
1) Huntington disease 第4染色体にある。常染色体優性変異 第4染色体上のhuntingtin遺伝子
が作るタンパク質3145 アミノ酸のHuntingtinの中のグルタミン酸(CAG)繰り返しが、増えて、
異常タンパク質が出来、それが脳に蓄積する。
CTGCCGTGCCGGGCGGGAGACCGCCATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCTTCGA
METAla Thr Leu Glu Lys Leu MET Lys Ala Phe Glu
GTCCCTCAAGTCCTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCA
Ser Leu Lys Ser Phe Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
GCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCCTCA
Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Gln
GCTTCCTCAGCCGCCGCCGCAGGCACAGCCGCTGCTGCCTCAGCCGCAGCCGCCCCCGCC
Leu Pro Gln Pro Pro Pro Gln Ala Gln Pro Leu Leu Pro Gln Pro Gln
Gln -- CAA CAG
Pro -- CCG CCU CCC CCA
Frameshift mutation and diseases-2
2) Fragile X syndrome (FRAX) 脆弱X症候群
x-染色体上のFragile X Mental Retardation 1 (FMR1)遺伝子のCGG繰り
返し配列の伸長(200個以上)の結果,遺伝子発現不全となり,「精神
障害」などの症状に陥る。
ACGGCGAGCGCGGGCGGCGGCGGTGACGGAGGCGCCGCTGCCAGGGGGC
GTGCGGCAGCGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCG
GCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGG
CGGCTGGGCCTCGAGCGCCCGCAGCCCACCTCTCGGGGGCGGGCTCCCGG
CGCTAGCAGGGCTGAAGAGAAGATGGAGGAGCTGGTGGTGGAAGTGC
GGGGCT
3)
Poly-CAG
repeat
によるHuntington以外の神経系の遺伝病。
dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA), spinobulbar muscular
atrophy (SBMA) and spinocerebellar ataxia (SCA) types 1—3, 6, 7
and 17
繰り返し(repeated sequence)を複製する際にslipすると,
繰り返しの増加や減少(frameshift)が生じる。
Mutation = Damage - Repair
ATGCCAATCCG
substitution
ATGCCGATCCG
insertion
deletion
A
transitions
G
ATGCCGAATCCG
transversions
ATGCCGATCCG
deletion
insertion
ATGCCG ATCCG
NNNN---N
When ancestry is uncertain, mutations are
designated as mutations relative to an
arbitrarily chosen "wild type" genome. They
are classified as substitution, insertion or
deletion mutations. Insertions or deletions
can be small (one or a few nucleotides) or
large (more than a few dozen nucleotides).
T
C
Substitution mutations from one pyrimidine
to another or one purine to another
(horizontals in diagram) are called
transitions. Mutations from a pyrimidine to
a purine, or the reverse (verticals and
diagonals in diagram), are called
transversions. Transitions are more
frequent than transversions
Structural Mutations
1. deletions
= loss of sequence
2. inversions
= reversal of orientation
3. translocations = displacement
4. duplications = multiplication
主な原因: 放射線,紫外線,複製エラー,組み
換えエラー,
染色体レベルの突然変異
1. polyploidy = multiple sets of
chromosomes
2. aneuploidy = absence or multiple
chromosomes
原因;減数分裂時の染色体不分離,チューブ
リンの機能不全。がんの発生に強く関わる
ゲノム(ゲノム研究)
ゲノム;ある生物がもつ遺
伝情報の全体。ゲノムのな
かで生命活動を維持するた
めの機能的な部品を規定し
ているところを遺伝子。遺
伝情報の全体は染色体に保
持されている。
染色体;DNAと核タンパク
質の集合体。全遺伝情報が
ある。多細胞生物は,父親
からのと母親からの染色体
をそれぞれ持つ(1対)。
ヒトは23対持つ。
動原体
テロメア
分裂中期の写真なので,染色体が4本ある。
セントロメア
異数体
(aneuploidy)
4倍体
(倍数
体)
紡錘体チェックポ
イントの間違い
2倍体
(diploid)
Ploidyの変化
中心体複製
チェックポ
イントの間
違い
DNA損傷チェックポイントの間違
転座
欠失
遺伝子ある
いは染色体
の増幅
チェックポイントの
間違いが,染色体の
突然変異(数の変化
など)を導く
polyploidyの例
The consequences of mutation on the phenotype
loss of function = hypomorph (“null”)
多くの突然変異
gain of function = hypermorph
proto-oncogene → oncogene
haploinsufficiency
(+/-)の場合,酵素量が半分になり,機能が半
分になる。
dominance and recessiveness
ヒトなどのように染色体が2nで,遺伝子の片一方が変異で,
片一方が正常の時に,正常形質が現れると劣性変異
(recessive),変異形質が現れると優性(dominant)と
いう。
The consequences of mutation on
the phenotype
somatic mutations = cell death and
cancer
germ-line mutations = heritable diseases
it is assumed that every person has between 12 lethal alleles (heterozygosity protects from
deleterious effects of mutations)
heterozygosity
+/+
Point
mutation
etc.
-/+
-/-
変異
細胞
変異形質が現れる -- その変異はdominant
変異形質が現れない--その変異はrecessive
Haploinsufficiencyと劣性との区別が時に必要
Haploinsufficiencyとdominant negativeとの区別が時に必要
Glycosylase
Endonuclease
UV、活性酸素等
DNA polymeraseが関
わる突然変異
mismatch
YファミリーDNAポリメレース
(dinB, umuCD, RAD30, XPV等)
mismatch
Glycosylase, Endonuclease, Exonucease, Helicase
(polA, recJ, recQ, hns, topB, RAD27, FEN1等)
Glycosylase
Endonuclease
Exo/Hel
Exo/Hel
組み換えが関わる突然変異;gross rearrangement
damage
apoptosis
p53
HR
LOH
cell cycle arrest
NHEJ
GCR
突然変異の生成
DNA 複製に依存して生成するもの
1) Point Mutations
1. transitions 2. transversions 3. frameshift
mutations
2) Structural Mutations(小さいサイズ変化)
1. deletions 4. duplications
染色体(DNA) 組み換えに依存して生成するもの
Structural Mutations (LOH,GCR)
1. deletions 2. inversions 3.translocations
4. Duplications
細胞分裂に依存して生成するもの
1. Polyploidy 2. Aneuploidy
紫外線 Ultraviolet Light
X-Rays
Ultraviolet light
UV-C
UV-B
Visible light
UV-A
Ozone absorption
Transmitted by
normal galass
Air absorption
100
150
200
250
300
350
400 nm
UV radiation spectrum.
UV-A--360 nm以上、UV-B--280 or 290-360 nm、UV-C--280 nm 以下
紫外線(UV)によるDNA損傷
thymine
thymine
cyclobutane thymine dimer
6-4 photoproduct
1
紫外線感受性大腸菌
wild-type
10-1
組み換え修復の欠損した大
腸菌(recA)及び除去修復欠
損大腸菌(uvrA)は,紫外線
に感受性で,両方欠損した
二重欠損株(uvrA recA)は
きわめて感受性となる。二
重変異株の場合,約1個の
DNA損傷で,大腸菌は死
ぬ。
recA
生
-2
10
存
率
uvrA、uvrB、uvrC
uvrA recA
10-3
0.5 1
10-4
0
10
20
30
40
紫外線線量(J/m2)
50
除去修復モデル
UvrAタンパク質は
UvrBタンパク質を呼び
込みUvrBを傷に結合さ
せる。
Molecular Match Maker
UvrBとUvrCが切れ目を
入れる
色素性乾皮症(Xeroderma Pigmentosum; XP)
XP Patient
色素性乾皮症(XP)は,光
線過敏症の常染色体劣性
遺伝性皮膚疾患である。
この疾患の病因は,紫
外線によるDNA損傷の
修復機能の障害によるも
のである。又,XPは8群
(A〜G群とバリアント
群)に分類され,日本人
に多いA群は,皮膚疾患
に加え,進行性の中枢神
経障害や末梢神経障害が
出現する。
色素性乾皮症(XP)患者の皮膚細胞は紫外線に弱い
正常人
の皮膚
色素性乾皮症の皮膚
0
1
2
3
4
5
紫外線
6
7 8
(J/m2)
9
皮膚細胞を用いて
XP患者がなぜ紫
外線に感受性なの
かを実験すること
ができる。皮膚が
ん発症の仕組みを
実験することが出
来る。
Kazuo Yamamoto
XPと
発がん
高等生物の除去修復
RNA ポリメラーゼII
XPE (UV DDB)
損傷の認識
高等生物の除去修復
XPC-HHR23B
CSA,CSB
XPG
損傷周囲の二本鎖
DNAの巻き戻し
傷の認識
Transcription coupled repair (TCR)
Global genomic repair (GGR)
TFIIH
(XPB, XPD)
ERCC1-XPF
損傷両端での一
本鎖DNA切断
RPA
PCNA
RFC
XPA
XPG
傷のあるoligonucleotideの切り出し
DNAポリメラーゼdまたはe
修復合成
DNA鎖再結合
DNAリガーゼ
紫外線(UV)によるファージ突然変異と大腸菌recA
1
10-1
突
然 -2
変 10
異 -3
頻 10
度
10-4
10-5
野生株、uvrA欠損株
UV照射
UV照射宿主
UV非照射
UV非照射宿主
ファージへのUV照射
1
recA, lexA(Ind) 変異株
10-1
突
然 -2
変 10
異 -3
頻 10
度
10-4
10-5
UV照射
UV非照射
ファージへのUV照射
紫外線誘発突然変異生成にはrecA, lexA(Ind) 遺伝子が必要
紫外線(UV)によるファージ突然変異と大腸菌recA
突然変異が生じる遺伝子(ファージ)
にも,その宿主にも紫外線の傷が生じ
ることが必要である。
突然変異生成に新しいタンパク質
合成が必要である。
recA遺伝子,lexA遺伝子産物が関与し
ている。recA遺伝子,lexA遺伝子発現
は,紫外線によって誘導される。
紫外線によるrecA遺伝子の発現とrecA & lexA変異
発現量(U)
1500
野生株
1000
uvrA変異株
500
lexA変異株
recA変異株
0
5
10
15
UV(J/m2)
20
25
recA遺伝子は紫外線によって誘導される。その発現にはactiveな
recA遺伝子とlexA遺伝子が必要である。
紫外線は(DNA損傷は),recAをはじめ20以上の遺伝子の発現を
誘導する = SOS response
紫外線照射しても突然変異が生じない大腸菌突然変異の分離
1) recA変異株
2) lexA(ind-)株
3) umuCD変異株 -- 突然変異生成に直接働くタ
ンパク質をコードする遺伝子。
recA遺伝子,lexA遺伝子は調節タンパク質を
コードする
突然変異生成にはタンパク質合成が必要である。
紫外線によって生じる突然変異
-2
10
野生株
10-3
10-4
10-5
recA、
lexA(Ind)、
umuCD欠損株
10-6
10-7
10-8
0
20
40
突然変異生成には少
なくとも,3つの遺伝
子産物が必要である。
大腸菌は受け身的に
突然変異を生じるの
ではなくて,積極的
に変異を起こすシス
テムを内在させてい
る。
紫外線照射(秒)
uvrA欠損株では突然変異がよく起きる。
SOS モデル
Pol IV
Pol V
LexA の結合と分解
SOS OFF
lexA
umuC umuD
recA
SOS
ON
大腸菌SOS regulated genes
polB, dinB, umuCDは
損傷乗り越え型DNA
Polymeraseを作る
umuCD 遺伝子
P (SOS boxを持つ)
umuD
umuC
umuD遺伝子,15.000 Daタンパク質を作る
umuC遺伝子,45.000 Daタンパク質を作る
UmuD タンパク質にもLexAやCI タンパク質と同様にala-gly
配列があり,RecAの作用によってautocleavageを受け,活性型
UmuDとなる。
in vitroでUmuCと活性型UmuDの二量体は,complex を作る。
UmuCD2タンパク質は , DNA複製酵素の 活 性 が あ る (DNA
polymerase V)-その作用は,損傷部位で止まることなく無理矢
理複製する(translesion polymerase)。従って間違う可能性が高
い。Error-prone
umuCDタンパク質の作用モデル
活性型の2量体の
UmuDはUmuC,ε,
βと結合して,
DNA-PolymeraseV
として働く。
DNA Polymerase & UmuCD Polymerase
Pol III
UmuCD2
UmuCD2
SOS-responseで誘導されるDNA polymerase
1) PolB (DNA polymerase II)--- translesion synthesis
2) dinB(polymerase IV) --- translesion synthesis →フレ
ームシフト変異(1〜2塩基付加または欠失)を引き起こ
す
3) umuCD (Polymarese V) -- translesion synthesis → 塩
基置換変異を引き起こす
β-タンパク質(β-clamp)とcomplexを作り,複製する。
Replication forkでの損傷回避
組み換え
損傷乗りこえ
Leading鎖に損傷ができて、
replication forkが停止した場
合;
A forkの崩壊--死
B forkの後退、chikenfoot構
造を取り、修復する。組み換
え酵素が関わる。
C 複製の再開、translesion
synthesis polymeraseが機能
する。
損傷乗り越え複製
大腸菌の場合,polII,
PolIV, PolVが関わる。
突然変異を伴う。
ヒトの場合,Pol e,Pol
等が関わる。
PolV-catalyzed TLS and RecA
Goodman MF (Molecular Cell, Vol. 17)より
Pol VによるDNA複製は,紫外線損傷(X)があっても無くても,RecA
タンパク質に依存する。
PolV-RecA結合モデル
RecAは,PolVと結合して,
DNAへの結合を助ける。
紫外線損傷の突然変異誘発作用
1) RecAタンパク質を活性型にし,LexAの分
解を促す。→SOS (polB, dinB, umuCD)誘発
2) RecAタンパク質を活性型にし,UmuDの
分解を促し,活性型UmuDを作る。
3) 突然変異の鋳型となる
紫外線によって生じる突然変異
10-2
野生株
10-3
10-4
10-5
uvrA欠損株で
は突然変異が
よく起きる。
10-6
recA、
lexA(Ind),
umuCD欠損株
10-7
10-8
0
20
40
除去修復がないから
紫外線による突然変異の解析
大腸菌とλファージとを別々に紫外線
照射する。
GC→AT
UV to λ
5’TC- 10
5’CC7
PuCPy- 1
PuCPu- 1
UV to λ then PR
2
3
1
1
AT→GC
5’ TT- 17
14
5’CT0
1
PuTPy- 1
3
PuTPu- 0
1
____________________________
合計
37
31
PR = 光回復,ピリミジン二
量体をDNAから除く。
両者をmixし、,λファージの突然変
異を調べる。
必要ならmixした後光回復をし,λ
ファージの突然変異を調べる。
λファージ変異体のDNA配列を求
め,野生型ファージの配列との違
いを求める。
例えば5’-ATCG-3’が5’-ATTG-3’
になっていたとすると,GC→AT
があるとカウントする。
紫外線誘発変異の解析結果
1) Pyrimidine-pyrimidine (PyPy) の位置で、3’ Py が変
化している。
2) CT では変異は起きない。
3) TC, CC 部位での変異は光回復処理で消えるが,TT
部位でのそれは消えない。
以上から得られる結論
1)紫外線損傷が生じると考えられる位置で変異が
起きている。損傷そのものが鋳型となっている。
2)CT 損傷は変異の基質にならない。
3)3’が変異となる。
4)TC, CCは光回復できる。→ CPD。TTはできな
い。→ CPDではない。
大腸菌はCPD-photolyaseしか持っていない。
A rule model
3'
5'
T^C
5'
T^C
A
3'
5'
3'
TT
AA
3'
5'
Pol III
(or UmuCD)
Pol III
(or UmuCD)
C to T transition
5'
T^T
Pol III
(or UmuCD)
3'
5'
T^T
A
3'
5'
3'
TT
AA
3'
5'
Pol III
(or UmuCD)
no mutation
in vitroでUV 損傷のあるDNA を鋳型に複製させると,3’の
向かいには,Aが入りやすい。つまり,T^C, C^CではCの向
かいにAが入るので変異となる。T^T, C^Tの場合,Aが入る
と,本来のpairingなので正常配列になる。
TC, CC変異でのdeamination model
NH2
O
4
HN3
H
5
2
H
6
O
1
N
H
NH2
4
N3
2
deamina tion
O
2
O O
2
1
5
6
6
N N
TU dimer
H
N
H
NH2 O
H
4
5
1
6
cytosine
O O
HN3HN
3
H
1
uracil
4
5
CH3
NH2
deamina tion
4
N3HN3
2
O O
2
1
H
4
5
5
6
6
1
N N
TC dimer
CH3
TC, CC 二量体の
3’Cはとりわけ
deaminationの頻
度が高い → DNA
polymeraseV
(UmuCD)は
deaminateした
C(=U)をTと間違え
てA をいれ,C→T
transitionが出来
る。
大腸菌での紫外線誘発突然変異のまとめ
紫外線損傷(ピリミジン2量体,6-4付
加体)が突然変異の基質となる。
Translesion synthesis(TLS) polymerase
(polII, polIV, polV)が複製停止した
polIIIに取って代わる。
紫外線損傷がTLS polymeraseを誘導す
る。
Replication fork stallとTLS
組み換え
損傷乗りこえ
Leading鎖にUV損傷ができて,
replication forkが停止した場
合;
A forkの崩壊--死
B forkの後退、chikenfoot構
造を取り修復する。組み換え
酵素が関わる。
C 複製の再開,translesion
synthesis polymeraseが機能
する。突然変異が増える。
組み換え経路をblock
すると,損傷乗り越
え経路が活発になり,
その結果突然変異が
増える。
Cell cycle
紡錘体チェックポイント
2c
損傷チェックポ
イントG2/M
M
中心体複製
チェックポイ
ント
G2
2c
RESTING
G0
DIVISION
GROWTH
FACTORS
G1
4c
S
INTERPHASE
ヒト培養細胞の場合,全体は概ね24時
間でM期は0.5時間程度
2c
損傷チェックポ
イントG1/S
Swe1 (Wee1),Cdc25によるG2/M境界checkpoint
Cdc25
P
P
P
CDK1(Cdc28)
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
P
/Cyclin
B
B
Swe1
G2期
prophase
G2/M 境界
G2/M境界では,Swe1はMPFをリン酸化することで,周期の進行を遅ら
せ,Cdc25 phosphataseは脱リン酸化することで,周期を前に進める。
PHQはSwe1 (Wee1)を安定化するので,MPFを不活性型に保ち
elongated bud形成を促す。
G2/M境界checkpointシグナルと異数性の生成
Chk1
Chk1
P
ATM/ATR
DNA damage
14-3-3
p53
P
P
Cdc25
P
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
S arrest
p38
環境ストレス
(ROS等)
chk2
P21
p38
P
B
inactive = G2
Wee1
G2/M 境界arrest
???
P
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
B
active = M
Aneuploidy--> 発がん/老化
Diploid (2n)とhaploid (n)
ヒトの場合,精子や卵子はhaploidで22本の常染
色体の1つずつとXまたはYをもつ
たいていのヒト細胞はdiploid (2n)で,2本の相
同な(但し同一ではない!)染色体をもつ。
ヒトのG2期細胞はtetraploid (4n)となっている。
相同染色体がそれぞれ,同一の染色体2本
(sister-chromatid)で構成される。
塩基置換などによる突然変異は複製(コ
ピー)エラーの結果である
DNA複製誤りが原因である。
複製誤りを修復するシステム(mismatch
repair)を生物は持っている。
mismatch repairが欠損すると,ヒトは大腸
がんになる(hereditary nonpolyposis colon
cancer; HNPCC) -- 細胞の突然変異頻度が高
いから。
大腸菌自然突然変異
大腸菌DNApolymeraseによる複製誤り頻度は
200 x 10-8/cell/genenration。
複製後ミスマッチ修復系が働いて,変異頻度は
2 x 10-8となる。
高等生物(ヒト,植物,酵母など)での自然突然変
異頻度も,同様のしくみが働いて,変異頻度は
2 x 10-8〜10-6となる。
塩基が変化するような突然変異はおおよそ 10-8
の頻度で生じる。
発がん
がんは,oncogeneがpower-upあるいはがん抑制遺伝子がpower-down
正常細胞
正常マウス
がん細胞
がん細胞が一つあるマウス
がんマウス
細胞のがん化; 1つのがん細胞が出来る過程
マウス/ヒトのがん化;がん細胞が一つある状態から,たくさん
ある状態になるまでの過程。十数年以上かかる
全ての過程には,少なくとも6〜10個の遺伝子が関わる
がん(cancer)
1) 一つの疾患ではなくて,似たような細胞特性をもつ,
多くの疾病の総称。
2) すべてのがん細胞は,6〜10個の遺伝子突然変異の結
果,成長の制御が不能に陥ったものである。
がんは体細胞の病気である。
3) がんの約1パーセントは家族性(familial)で,この
場合,家系内でがんにかかりやすい遺伝子変異がある。
残りの99パーセントは散発性(sporadic)で,この文
脈では家族性ではない事を意味し,体細胞の突然変異の
結果である。
4) 正常細胞からがん細胞への転換には,複数のプロト
オンコジーンとがん抑制遺伝子突然変異(6-10個)を必要
とする。
protooncogeneとがん抑制遺伝子
がんとの関わり;
1) protooncogeneの機能は,細胞分裂を促進するか,apoptosisを
阻止すること。Oncogeneはprotooncogeneのpower up型
Ras--星状細胞腫(astrocytoma)の45パーセント,神経膠芽腫
(glioblastoma;)の35-50パーセント
サイクリンD--食道がんの35パーセント,膀胱がんの15パーセント,
乳がんの15パーセント
2) がん抑制遺伝子(tumor suppressor gene)の機能は,細胞分裂を
阻害するか,アポトーシスを促進すること。
P53--すべてのがんの半数以上で,p53が機能を失っていることが
示されている
p16/p19ARF--神経膠腫(脳腫瘍の一種)の55パーセント,中皮腫
(mesothelioma)の55パーセント,黒色腫の50パーセント以上で,
機能喪失が観察される。
遺伝子が特定された病気(一部)
染色体
代表的がん遺伝子名
その他病気遺伝子数
●がん遺伝子Nras(p13.2) ●がん遺伝子trkA(q23-q24)
78
●乳がん(p36)
2染色体
●遺伝性非ポリポーシス大腸がん(p22-p21とq31-q33)
45
●がん遺伝子Nmyc(p24.1)
5染色体
●大腸がん(q21) ●大腸ガン抑制遺伝子MCC
32
●家族性大腸ポリポージス抑制遺伝子APC(q21-q22)
第7染色体
●大腸がん(p22) ●がん遺伝子met(q31)
44
第13染色体 ●網膜芽細胞腫抑制遺伝子RB ●家族性乳がん(q12.3)
18
第15染色体 ●がん遺伝子fea(q26.1)
23
第17染色体 ●乳がん(p13.3)p53に関連 ●がん遺伝子erbB2(q11)
52
●神経線維腫症1型(レックリングハウゼン病)
●がん遺伝子erbA(q11.2) ●がん抑制遺伝子p53(p13.1)
●家族性乳がん(q21) ●乳がん抑制遺伝子プロヒビチン
第18染色体 ●がん遺伝子yes(p11.3) ●遺伝性非ポリポーシス大腸がん(q1)
17
●膵臓がん・大腸がん(q21.1)がん抑制遺伝子●がん抑制遺伝子DCC
1染色体
1回のaneuploidyで複数の遺伝子変化を起こすことが出
発がんと突然変異
がん細胞のoncogene,TSGに変異がある
突然変異頻度の高い遺伝病(ミスマッチ欠損,色素性乾皮膚
症など)は,発がん頻度が高い
発がん化学物質は突然変異誘発作用がある
がん突然変異説を信じるとして,例えば6個の遺伝子変異で
がんになるとする。それぞれの遺伝子突然変異頻度を10-5
として, 6個の遺伝子変異で説明すると,がんに至るまで
の頻度は(10-5)6 = 10-30 /cell/generationとなる。
ヒト個体は,1012-1013 の細胞で構成されている。生涯の細
胞数を1014と仮定(100歳まで生きるとすると,合計は
36500日;分裂するstem cellが仮に0.1%あり,1日1回分
裂するとすれば,1013 x 0.1% x 36500 = 36500 x 1010 =
3.65 x 1014;stem cellの分裂は1:1)しても,突然変異だけ
で説明すると,ヒトはがんに罹る可能性はきわめて低い。
環境化学物質の突然変異原性(遺伝毒性),発がん性の試験
1) エームス(Ames)試験--サルモネラ菌を用いて, DNA損傷
に依存したDNA複製依存性突然変異原性の有無を調べる。
2) マウス実験--化学物質を数百匹のマウスに投与し,2年間
飼育して,発がん性を調べる。
変異物質
変異・非発がん
物質;例,ヒド
ロキシルアミン,
9-アミノアクリ
ジン
発がん物質
非変異・発がん物
質;例,アスベス
ト,ベンゼン,ophenylphenol
変異・発がん物質(50-60%);例,
過酸化水素,ニトロソグアニジン,
放射線
変異・非発がん物質が存在
非変異・発がん物質が存在
放射線誘発突然変異と細胞悪性形態変化の頻度は違う
生存曲線●
X線を照射したゴールデンハムス
ター細胞を二群に分け,一方で細
胞悪性形態変化 (malignant
morphological change)を指標にし
て細胞がん化頻度を求め,他方で
HGPRT遺伝子座における体細胞突
然変異頻度を調べた(京都大学,
渡邉正己)
細胞悪性
形態△
突然変異□
10-5
細胞がん化と突然変
異誘導動態が全く異
なる
突然変異による発がんとaneuploidyによる発がん
突然変異だけで説明すると,ヒトはがんに罹る可能性はきわめて低い
(前の頁の説明)。
遺伝子の変異が生じると,その表現型はすぐに現れる。がんは10年以
上の時間をかけてゆっくり発病する。
世の中には非変異・発がん物質や変異・非発がん物質が存在する。突
然変異だけでは発がんを説明できないことの証拠。
非変異・発がん物質は,M期arrest,中心体の断片化,異数化等を誘
発する。変異・発がん物質も中心体の断片化やaneuploidyを誘発する。
ほとんど全てのがん細胞でaneuploidyは観察される。
異数性だけではがんにはならない(Bub変異の両親;広島大,松浦)。
突然変異とaneuploidyは共に発がんmultistepにかかわ
る。
大腸直腸がん
Science, vol297,
2002
がん突然変異説に対する疑問
がん細胞の染色体数は正
常細胞のとは異なる。
Aneuploidy(異数性)
Aneuploidy(異数性)
Polyploidy(倍数性)
Aneuploidy (異数性)とがん
ひと大腸直
腸がん細胞
Jallepalli &
Lengauer
(2001)
同じCAN1遺伝子の変異でもdiploidとhaploidで突然変異頻度が異なる
カナバニン抵抗性突然変異(CanR)
10-2
10-3
diploid (CAN1/Δcan1)
10-4
組み換えによる
変異≒ LOH
10-5
haploid
10-6
10-7
0
50
100
紫外線 (J/m2)
複製誤りによ
る変異
酵母のCAN1遺伝子の突然変異を調べると,diploid heterozygousの
時は,haploidに比べて頻度が100倍高い。組み換えなどによるloss
of heterozygosity (LOH)の頻度が高いからである。
Kazuo Yamamoto
ADE2
酵母aneuploidy実験系とCanRの生成
0
can1⊿
LYS2
20
40
60
80 %
遺伝子変換
組み換え
ADE2
aneuploidy
ADE2
0
20
40
60
80 %
遺伝子変換
LYS2
CanR ADE+
LYS+
組み換え
CanR ADE+ CanR adelyslys-
遺伝子
組み換え 異数性
変換
ADEとLYSのマーカーによっ
て,CanRを分類をする。
MMS,H2O2処理で,頻度は
約10倍上昇する。
aneuploidy
0
20
40
60
80 %
遺伝子変換
組み換え
aneuploidy
DNA損傷物質は組み換えとaneuploidyを誘発する
0
非変異・発がん物質によるaneuploidy
ADE2
20
40
60
80 %
遺伝子変換
組み換え
can1⊿
aneuploidy
LYS2
遺伝子変換
組み換え
ADE2
ADE2
CanR
ADE+
LYS+
遺伝子
変換
CanR
ADE+
lys-
組み換え
CanR
ade-
lys-
aneupl
oidy
無処理-1 x 10-4
Acrylamide (AA 100 mM) 1x 10-3
Acrylonitrile (AN 75μM)9 x 10-4
Carbendazim (CD 0.2 mM) 6 x 10-4
CD 0.2 mM
LYS2
AN 75μM
aneuploidy
遺伝子変換
組み換え
aneuploidy
遺伝子変換
組み換え
aneuploidy
化学物質によるaneuploidy生成機構;o-phenyl phenol ,PHQの作用機構
輸入柑橘類の防カビ剤として使用されるポストハーベスト剤。突然変異
は誘発しない。DNAに作用しない。マウスに膀胱がんを誘発する。
O2 O2-
NAD• NADH
Fe3+ Fe2+ OH
phenylhydroquinone (PHQ)
10-2
100
Frequency
CanR-frequency
Surviving fraction
OPP
OH
O
O・
OH
OH
10-1
10-2
10-3
10-3
O
Phenyl
benzoquinone (PBQ)
0 (mM)
0.1
0.25
0.5
10-4
10-5
10-4
0.00
0.25
OPP (mM)
0.50
塩基置換
遺伝子
変換
組み換え aneuploidy
100
100
致死作用
10-1
10-2
CanR変異頻度
10-3
80
60
40
20
10-4
0.00
1)
2)
3)
4)
5)
Distribution (%)
Can-R frequency
Surviving fraction
PHQのaneuploidy誘導性
1.00
2.00
DHBP (mM)
0
0
1
DHBP (mM)
1.5
致死作用に閾値がある。
CanR 変異(LOH)が濃度依存的に誘導される
aneuploidyの誘導
塩基置換型突然変異の誘発はない
マウスに膀胱がんを誘発する
ヒト培養細胞でもPHQはAneuploidyを引き起こす
Proportion of chromosome
numbers (%)
70
60
HCT116 : 染色体数 主に45本
Chromosome numbers
50
≦40
41
42
43
44
45
46
≧47
40
↓
Wash
↓
通常の培地で
30
数日培養
20
↓
10
0
PHQ16hr処理
染色体観察
No treated 1day
2day
3day
4day
5day
57
57
day after addition of PHQ
Aneuploidy (%):
43
73
67
56
DNA損傷を作らないPHQでもAneuploidyを誘
発
A 100
YPD
G1-S
80
B
60
40
20
0
.
0
180
G2-meta
50
150
Ana
100
150
200
2 mM PHQ
100
80
G2-meta
G1-S
60
60
0
20
0
0
12
0
90
30
40
.
PHQは,酵母の細胞周期をG2-M期で停止する
Ana
50
100
150
200
Minutes after release from G1
YPD
2 mM PHQ 15 g/ml Noc
PHQ 処理すると酵母の形態異常 (elongated bud)が観察される
拡大図
YPD
0.1% MMS 15 g/ml Nocodazole
2 mM PHQ
Budの形態形成が不十分な状態で周期の進行が止まっている。
Mophogenesis checkpoint -- G2/M境界でdelay。
正しい状態を確認してMPFを活性化してM期に進む。
酵母swe1(wee1 homolog)欠損株ではelongated bud形成は無い。
Swe1欠損株ではG2/M境界delayも無い。
MPF = mitosis promoting factor = CycB + Cdk1 (Cdc28)
Swe1 (Wee1),Cdc25によるG2/M境界checkpoint
Cdc25
P
P
P
CDK1(Cdc28)
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
P
/Cyclin
B
B
Swe1
G2期
prophase
G2/M 境界
G2/M境界では,Swe1はMPFをリン酸化することで,周期の進行を遅ら
せ,Cdc25 phosphataseは脱リン酸化することで,周期を前に進める。
PHQはSwe1 (Wee1)を安定化するので,MPFを不活性型に保ち
elongated bud形成を促す。
PHQはSwe1を安定化する
Time (min)
0
30
45
60
75
90
105
Swe1
YPD
Loading
control
0
2 mM PHQ
30
45
60
75
90
105
Swe1
Loading
control
α factorでG1に同調し,release後65分にPHQを加
10%SDS-PAGEで流してwestern blotting
PHQはSwe1のリン酸化を抑制して安定化する
100
Swe1欠損株YPD
G1-S
80
Swe1変異株ではPHQ処理して
も細胞周期は正常に進む
Swe1株のFACS
YPD
60
40
180
20
G2-meta
0
0
50
100
150
Ana
100
150
200
Swe1欠損株2 mM PHQ
G1-S
80
12
0
90
60
60
30
40
0
G2-meta
20
0
2 mM PHQ 15 g/ml Noc
Ana
0
50
100
150
200
Minutes after release from G1
Swe1欠損株ではPHQ処理は周期を止めない
Mad2変異株ではPHQは周期を止める
PHQはG2/M境界で周期を止める
DNA damage checkpointとG2/M transition checkpoint
Chk1
Chk1
P
ATM/ATR
DNA damage
14-3-3
p53
P
P
Cdc25
P
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
S arrest
p38
環境ストレス
(ROS等)
chk2
P21
p38
P
B
X
Wee1
G2/M 境界arrest
P
CDK1(Cdc28)
/Cyclin
B
Swe1(Wee1)はHog1(p38MAPK)およ
びChk1の下流
PHQはHog1(p38)をリン酸化する
NaCl
0
30
60
PHQ
30
60
DMSO
30
60
MMS
30
60
Nocodazole
30
60 min
p-Hog1p
Hog1
PHQはHog1をリン酸化し,その下流のSwe1を安定化する
PHQはCdc25をリン酸化(不安定化)する(HCT116での結
従って,PHQはG2/M transitionで細胞周期を止める。
PHQ作用のまとめ
(1)PHQはMAPK経路を活性化(Hog1-Swe1経路)す
ることにより, 細胞周期をG2/M境界で止める
(2)Hog1-Swe1経路は PHQが誘発する異数性
(Aneuploidy)の中心経路である
(3)PHQはATM/ATRを活性化しないので,chk1由
来のG2/M境界arrestは起きない。Chk1変異株は野生
株と同じようにPHQに反応する。
PHQ (μM)
PHQはヒト培養細胞にアポトー
シスを誘導する
Cont Noc 100 125
細胞
薬剤で48時間
処理後,DNA
の断片化と,
apoptosis特異
的PolyADP
ribose
polymerase
(PARP)の分解
を見た。
116kDa
85kDa
PARP
核(DAPI)
No
treated
Noc
PHQ
Actin
Nocodazole 150 nM。
PHQ 100 M。
Kazuo Yamamoto
PHQは中心体の増幅もしくは断片化を誘導
Interphase
-PHQ
PHQ処理(16hr)
-tubulin
核
merge
≧3の割合
1.9 %
4.9 %
Mitosis
-PHQ
PHQ処理
(16hr)
2.4%
11.4%
非変異・発がん物質OPP
1) エームス試験陰性。大腸菌,ヒトやマウスの培養細
胞などでも突然変異は誘導しない。Haploid酵母で
も突然変異誘発はない。DNA損傷は作らない。
2) マウスに膀胱がんを作る(aneuploidy を伴う)。
3) 染色体喪失型LOH(monosomy =aneuploidy)の誘
発と発がん。
-仮の説明●もし一方の染色体上のがん抑制遺伝子に前もって突
然変異があるとき,OPP処理で正常遺伝子を持つ
染色体が喪失すると(-/0)となりがんになる。
●一方の染色体が喪失すると,がん抑制遺伝子が
(+/+)から(+/0)と半分になる。ゆくりとがんになる。
Aneuploidy(CIN)を考えると何がいえるか
塩基置換変異(MIN)の10倍の頻度で生じる
非常にまれというわけではない
染色体22本対を考えると,1対の染色体には
複数のがん関連遺伝子が乗っている。
1回のeventで複数の遺伝子の変化を説明できる
がん抑制遺伝子で発現量の低下による発がんがある
Protooncogeneで発現量の増加による発がんがある。
a) がん抑制遺伝子の場合
Aneuploidy (CIN)とがん
+
1) Heterozygous (-/+)から(-/0)となる
2) Homozygous(+/+)から(+/0)となる
b) proto-oncogeneの場合
+
正常protooncogeneが
3個になる→増殖傾向
Probability of tumor-free
P53(+/-) マウスの発がん機構
(Kuperwasser C et al., Am J Pathol. 157:2151-2159, 2000.)
Balb/c p53+/+
(n=5)
Balb/c p53-/+
(n=56)
1) LOHの結果(-/0)となる
Balb/c
p53-/(n=85)
(+) alleleのloss-- 乳ガン
2) (-/+)のまま
p53量が1/2 -- lymphoma
haploinsufficiency
Weeks
矢印 は 50%のマウスにガンができる週。
がんは突然変異?Aneuploidy?
ヒトがん細胞にはaneuploidyがあるか突然変異が
あるか?
--両方ある
Non-mutagenic carcinogenはすべてaneuploidyを
導くか?
-- 一部YES, 一部NO
染色体の増減で,protooncogene,がん抑制遺伝
子の発がんの機構をすべて説明できるか?
-- 出来るのもあるし,出来ないのもある
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