下水試料を対象としたエストロゲンの
GC/MSによる高感度測定法
帝人エコ・サイエンス(株)
○末岡峯数、 大岩俊雄、 田辺 薫
独立行政法人土木研究所
八十島誠、 小森行也、 田中宏明
目 次
1.
2.
3.
4.
はじめに -
測定対象エストロゲン
試料の前処理フロー&GC/MS測定条件
誘導体化の検討
測定精度
(1) 検量線
(2) 繰り返し測定精度
(3) 添加回収試験
5. 下水試料の測定結果
6. まとめ
付表
GC/MSクロマトグラム-標準液&下水試料
1.はじめに
・下水試料は多くの夾雑成分を含むため、前処理精製法が重要で
ある。
・エストロゲン類のホルモン作用は、内分泌撹乱化学物質のエスト
ロゲン様活性に比べて高く、低濃度でも生物的影響を及ぼす可
能性があるため、高感度測定法が必要である。
・LC-MS/MS法より更に高感度測定法の検討と確認。
測定対象エストロゲン
2.下水試料の前処理精製フロー
基 本 フロ ー
E1 ,
E2 ,
E E 2 測定
E1 ,
E2 ,
EE2 ,
E 3 測定
試 料
↓
濾 過
↓
ろ 液
↓
←
SS 抽出液は濾液に
(MeOH 超音波抽出)
サロゲート 添加
各 d体
20ng
固相抽出
↓
溶 出
↓
濃縮乾固
↓
溶 解
↓
遠心分離、N2ブロー乾燥
←
溶出溶媒 6ml
←
←
10ml
溶出溶媒
E tO A c/M eO H (1/1)
10%アセト
ン/D C M
アセト
ン
洗浄
6ml
N 2ブロー
←
MeOH
1ml
←
MeOH
5ml
N 2ブロー
←
DMFA
BSA
100μl
200μl
TM S化
(80℃/60min)
↓
濃縮乾固
N 2ブロー
↓
溶 解
←
ウンデカン
↓
G C -M S
E tO A c/M eO H (5/1)
n-Hx/DCM(1/1) 1ml
N H 2カラム
↓
溶 出
↓
濃縮乾固
↓
溶 解
↓
O asi
s H LB
N 2 ブロー
フロリ
ジルカラム 同 上
↓
溶 出
↓
濃縮乾固
↓
溶 解
↓
C 18 カート
リ
ッ
ジ
100μl
HR-GC/MS測定条件
G C
装置
H P 6890 S eries
カラム
H P -5M S 0.25m m × 30m
温度
150℃ - 300℃ (20m in)
(昇温速度)
M S
( 20 ℃・
m in-1 )
注入量
1 μl
装置
JEO L JM S -700D ( 二重収束型 )
イオン化
EI ( + )
分解能
1000
測定イオン(S IM )
測定対象
S IM (m /e)
T M S 化物
E1 /E1-d2
342.21
344.22
3-T M S -E1
E2 /E2-d3
416.26
419.28
3,17-T M S -E2
EE2-1/EE2-d4
368.22
372.25
3-T M S -EE2
EE2-2/EE2-d4
425.24
429.26
3,17-T M S -EE2
E3 /E3-d2
504.30
506.31
3,16,17-T M S -E3
HR-GC/MS 測定条件 2
参 考
TM S 化物のM S (EI)イオンの相対強度
TM S 化物
M
+
+
〔M -C H 3)〕 備 考
3-TM S E1
10
(1 )
3,17-TM S -E2
10
(1 )
3-TM S -EE2
9
(1 )
3,17-TM S -EE2
(1 )
2
3,16,17-TM S -E3
11
(1 )
( 1 ) : 基準
4.測定精度
(2) 繰り返し測定精度
標準液の繰り返し測定 (LC -M S /M S 法との比較)
注入量 10 pg
測定対象
G C /M S 法
LC -M S /M S 法
注入量 1μl/10ppb(1ng/0.1m l)標準液
注入量 10μl/ 1ppb(1ng/1m l)標準液
H R -G C /M S 測定(n=6)
平均値
C .V .
ID L
ppb
%
pg
LC -M S /M S 測定(n=6)
平均値
C .V .
ID L
ppb
%
pg
E1
10.44
1.2
0.37
1.11
6.0
2.1
E2
9.97
0.5
0.15
1.11
6.9
2.3
EE2
10.58
1.4
0.44
0.99
10.4
3.1
E3
10.61
1.7
0.53
1.19
10.4
3.7
ID L :装置検出下限(注入量の 3S値)
LC-MS/MSとの検出下限値の比較
測定対象
H R - G C /M S 法
-1
ng・
l
参考
LC -M S /M S 法
-1
ng・
l
E1
0.04
0.2
E2
0.02
0.2
EE2
0.04
0.3
E3
0.05
0.4
分析試料量
1 L
検出下限値
標準試料の繰り返し測定の 3 S 値
4.測定精度
(3) 添加回収試験結果
測定対象
無添加
ng
純水
添加
ng
二次処理水
流入水
回収率 無添加 添加
回収率 無添加 添加
回収率
%
ng
ng
%
ng
ng
%
E1
0.1
20.1
100.1
1.0
21.5
102.6
4.0
26.0
110.0
E2
0.0
21.1
105.7
0.2
20.2
99.6
1.2
22.0
103.6
EE2
0.0
18.9
94.6
0.0
18.9
94.5
0.0
18.7
93.5
E3
0.0
20.0
99.9
0.9
20.3
97.0
24.3
44.4
100.5
試料
純水 、二次処理水 、流入水
添加量
各 20 ng
内部標準(サロゲート)
各 20 ng
( 各 0.5L )
5.下水試料のエストロゲン測定結果
下水処理場概要
水処理方式
標準活性汚泥法
エスト
ロゲン測定結果
HR-GC/MS 法
下 水 試 料
E1
流入下水
二次処理水
(最終沈殿池流出水)
測 定 対 象
E2
EE2
備 考
E3
28.84
3.99
<0.04
99.82
4.78
0.24
<0.04
0.41
-1
単位: ng・
l
(参考) LC -M S /M S 法
下 水 試 料
E1
流入下水
二次処理水
(最終沈殿池流出水)
測 定 対 象
E2
EE2
備 考
E3
27.2
3.2
<0.5
130.1
4.4
<0.5
<0.5
<0.5
-1
単位: ng・
l
E E 2 は流入下水及び二次処理水とも検出されなかった。(検出下限値以下)
6. まとめ
 下水試料を対象としたエストロゲン遊離体4種(E1,E2,E3,EE
2)についてHR-GC/MSを用いた高感度測定法について検討した。
 下水試料の前処理精製法は、既報のLC-MS/MS法で実施して
いる方法に準じて実施した。
 誘導体化は市販のシリル化剤について比較し、反応が早く濃縮が
容易なBSA(N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamide)を用いて検討した。
 エストロゲン遊離体のBSAシリル化物のHR-GC/MS測定は、以
下のSIMイオンを用いて測定した。
E3
EE2
E2
E1
測定対象
3,
16,
17-T M S -E 3
3,
17-T M S -E E 2
3-T M S -E E 2
3,
17-T M S -E 2
3-T M S -E 1
シリル化物
M
+
〔
M -C H 3〕
+
M +
M +
M
+
S IM イオン
6. まとめ (2)
 HR-GC/MSを用いた測定は、四重極MSを用いたLC-
MS/MS法に比較して、いずれも約1桁高い検出感度が得
られた。
 下水試料への添加回収試験は、いずれも94~110%の
良好な結果が得られた。
 標準的な下水処理場の流入水 及び 二次処理水について
測定し、従来のLC-MS/MS法の検出下限値以下の濃度
まで検出できた。ただし、EE2については、流入水及び二
次処理水とも0.04ng・L-1のレベルを下回っていた。
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