特集光をつくる
X 線自由電子レーザーが拓く
生きた細胞のナノレベル観察
西野吉則 にしの よしのり
北海道大学電子科学研究所
オングストローム(10-10 m)ほどの短い波長をも
される。
つ X 線自由電子レーザー(XFEL)は,現在,日本の
超短パルス X 線による放射線損傷のない生物
SACLA とアメリカの LCLS でのみ利用可能な最
試料の観察のアイデアは,古くからあった1。こ
先端の光である。XFEL パルスの発光時間はフェ
の ア イ デ ア を 一 躍 有 名 に し た の が,2000 年 に
ム ト 秒(10
-15
秒)
オ ー ダ ー と,大 型 放 射 光 施 設
『ネイチャー』誌に発表された,スウェーデン・
SPring-8 からの X 線と比較して 1000 分の 1 以下
ウプサラ大学の Janos Hajdu らのグループによる,
の短さである。フェムト秒オーダーの超短パルス
計算機シミュレーションの結果である2。彼らは,
XFEL で試料を照らすと,試料が放射線によって
1 個または少数個の生体分子に,フェムト秒パル
大きな損傷を受ける前の一瞬の姿を捉えることが
スの強い X 線を照射すると,原子が動く間もなく,
できる。放射線損傷は,X 線や電子線などを用い
ほとんど損傷のない試料から高分解能での回折パ
て生物試料をナノから原子レベルで観察する際に,
ターンが取得可能であることを示した。このアイ
分解能を制限する大きな問題となっている。放射
デアの原理検証実験は,ドイツ・ハンブルクにあ
線損傷を低減するため,従来は,試料を極低温に
る紫外線~軟 X 線領域の自由電子レーザー施設
保つ方法がとられてきたが,XFEL は放射線損傷
FLASH を 用 い て,Henry Chapman ら に よ っ て
の問題を根源的に解決する可能性を秘めており,
2006 年に示され,XFEL 計画の大きな後押しと
生物試料の高分解能観察に革新をもたらすと期待
なった3。
Observation of living cells at the nano level opened up by X-ray
free-electron laser
KAGAKU
4
4
4
4
4
4
4
4
LCLS や SACLA の登場により,放射線損傷の
ない生物試料の測定が,オングストロームほどの
短い波長をもつ硬 X 線領域でも行えるようにな
Yoshinori NISHINO
0076
4
Jan. 2015 Vol.85 No.1
コヒーレント X 線回折パターン
生きた細胞
X 線自由電子レーザー
(XFEL)
マルチポート
CCD 検出器
集光鏡
マイクロ液体封入アレイ(MLEA)
図 1―パルス状コヒーレント X 線溶液散乱
(PCXSS)法の概念図
った。特に,微小なタンパク質結晶を次々と液体
折イメージングする測定が行われている9。
ジェットで打ち出し,XFEL による回折パターン
筆者らは,XFEL が可能にする放射線損傷のな
を取得する,シリアルフェムト秒 X 線結晶構造
い生物試料観察の特徴を活かして,生きた細胞の
解析(SFX)が盛んに行われている4。ショットごと
定量的なナノイメージングに成功した10。電子顕
に異なる結晶のサイズや方位は,データ解析によ
微鏡や X 線顕微鏡で用いられる線量は,放射線
り決定される。当初は,既知の構造をもつタンパ
に耐性をもつ微生物も死んでしまうほど強力であ
ク質結晶が実験に用いられたが,2012 年になり
るため,細胞を生きた状態でナノレベル観察する
未知の構造のタンパク質の原子構造が解かれた 。
ことはこれまで不可能であった。フェムト秒の超
この成果は,
『サイエンス』誌によって,2012 年
短パルス XFEL は,生きた細胞の X 線ナノイメ
の科学の 10 大ニュースの一つに選ばれた。また,
ージングに道を拓く。しかし,先行する LCLS で
吾郷日出夫らが SACLA で示したように,ループ
は,試料は真空中を飛翔しており,細胞を生きた
にマウントしたタンパク結晶に対して回折実験を
状態に保つことは困難であった。
5
あ ごう
行っても,放射線損傷の影響を受けることなく高
精度で結晶構造が決定できる 。
そこで筆者らは,パルス状コヒーレント X 線
溶液散乱(PCXSS)法と名づけた独自に考案した手
6
XFEL のもう一つの特徴である,ほぼ完全な空
法 を 用 い て,生 き た 細 胞 の 観 察 に 挑 ん だ。
間コヒーレンスを用いると,試料が結晶でなくて
PCXSS 法の概念図を図 1 に示す。PCXSS 法は,
も,コヒーレント回折パターンを用いて,試料の
溶液試料を測定できることが特徴である。生物が
イメージングができる。高分解能の X 線対物レ
生きていくためには水は必須であり,溶液の測定
ンズを作ることは技術的に困難なため,対物レン
が行えることは,生物試料観察にとって理想的で
ズの代わりに計算機を用いるコヒーレント回折イ
ある。PCXSS 法では,試料をマイクロ液体封入
メージングは極めて有効である。コヒーレント回
アレイ(MLEA)チップと呼ばれる,筆者らが独自開
折イメージングは,部分的にコヒーレントな放射
発したデバイスに入れる。MLEA チップには,
光を用いて技術開発が行われ,細胞や細胞小器官
窒化シリコン簿膜で挟まれた微小な溶液槽が,2
などの生物試料のイメージングが行われてきた 。 次元に多数配列されている。窒化シリコン簿膜は
7, 8
LCLS では,エアロゾルビームで打ち出されたサ
X 線の照射窓となるが,強力な XFEL のシングル
ブミクロン(10 m 以下)サイズの生物試料等に対し
ショットで簿膜が破壊されるため,多数の独立し
て,XFEL のシングルショットでコヒーレント回
た溶液槽が必要となる。
-6
X 線自由電子レーザーが拓く生きた細胞のナノレベル観察
科学
0077
実験では,Microbacterium lacticum という牛乳
1.0
の中に生息するサブミクロンの大きさの微生物細
胞を観察した。この微生物は,耐熱性があり,加
熱殺菌時に注意が必要な厄介者である。殺菌は製
画像強度
品の品質保持に関わるため,この微生物の研究は,
酪農においても重要性をもつが,大きさがサブミ
クロンと小さいため,通常の光学顕微鏡で内部構
造を観察することは困難である。XFEL 実験に先
立ち,MLEA チップ中に生きた細胞を閉じ込め
られることを,バクテリア細胞の生死を判別でき
る 蛍 光 標 識 を 用 い て 確 か め た。実 験 の 結 果,
MLEA チップ中に細胞を封入した後に,MLEA
チップを 1 時間真空中に置いても,ほとんどの
100 nm
0.0
図 2―XFEL で観察した生きた細胞の画像
細胞が生きていることを確認した。
PCXSS 測定を SACLA で行った。SACLA が発
生する光子エネルギー 5.50
keV(波長 0.225 nm ほど)
をナノメートル分解能で定量的に観察できる優れ
た手法であることが示された。今後,生きた細胞
の XFEL を,集光鏡を用いてマイクロメートルほ
を系統的に測定することで,未だ解明されていな
どの領域に集め,MLEA チップ中の生きた細胞
い原核微生物のゲノム複製やそれに続く細胞分裂
に次々と照射した。細胞からのコヒーレント X
などの,重要な細胞内現象の解明に繫がることが
線回折パターンは,SACLA で独自開発されたマ
期待される。また,XFEL の集光度をさらに向上
ルチポート CCD 検出器を用いて計測した。測定
させることにより,より小さな生体粒子の観察や,
したコヒーレント回折パターンをデータ解析する
さらなる分解能の向上も期待される。これにより,
ことにより,試料の画像が得られる。X 線は透過
従来の結晶構造解析などでは見ることのできなか
性が高く,主に軽元素からなるサブミクロンの大
った,溶液中の生体分子のナノ構造やダイナミク
きさの細胞を,ほぼ完全に通り抜けてしまうが,
スの解明が期待される。また,生物試料のみなら
XFEL が発生するコヒーレント X 線を用いること
ず,溶液中で機能を発揮する物質材料のナノレベ
により,重金属で細胞を染色するなどの人工的に
ル観察にも,重要な役割を果たすと期待する。
イメージコントラストを高める試料調製の必要が
なく,内部構造を鮮明に観察できる。
図 2 に PCXSS 法で観察した生きた細胞の画像
文献
1―J. C. Solem: J. Opt. Soc. Am., B3, 1551
(1986)
2―R. Neutze et al.: Nature, 406, 752
(2000)
を示す。細胞の画像には,極めて興味深い特徴が
3―H. N. Chapman et al.: Nat. Phys., 2, 839
(2006)
見られた。細胞の中には,ダンベル型をした画像
4―H. N. Chapman et al.: Nature, 470, 73
(2011)
強度の高い部分が存在した。この領域は,X 線散
乱強度の強い DNA などの物質で構成されている
ことが示唆される。実際に,画像強度の強い部分
は核酸で構成され,それ以外の部分はタンパク質
で構成されていると仮定すると,画像強度の高い
部分とそれ以外の部分の強度比を,定量的にほぼ
説明することができる。
筆者らの研究により,PCXSS 法が生きた細胞
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KAGAKU
Jan. 2015 Vol.85 No.1
5―L. Redecke et al.: Science, 339, 227
(2013)
6―K. Hirata et al.: Nat. Methods, 11, 734
(2014)
7―J. Miao et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 110
(2003)
8―Y. Nishino et al.: Phys. Rev. Lett., 102, 018101
(2009)
9―M. M. Seibert et al.: Nature, 470, 78
(2011)
10―T. Kimura et al.: Nat. Commun., 5, 3052
(2014)
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