じっけんレシピ
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培養容器コーティング方法
細胞の表面は一般的に陰性の電荷を帯びているので、細胞容器表面を何らかの要請電荷物質で覆うこと(コーティ
ング)で細胞接着が促進されます。細胞は生体内ではほかの細胞と細胞外基質に接しているため、コーティングの材
料としては細胞外マトリックス・タンパク質の代表的なもの:コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなどが使用されます。
製品名/由来
コラーゲンTYPE I ラット尾由来
コラーゲンTYPE I 仔ウシ皮膚由来
製品番号
形状
C9791
粉末
C7661
コラーゲン TYPE I
仔ウシ皮膚由来
C8919
コラーゲン TYPE I
ウシ皮膚由来
C4243
コラーゲン TYPE II
ニワトリ胸骨軟骨由来
粉末
付着標的細胞
6-10μg/cm2
6-10μg/cm2
滅菌済み
6-10μg/cm2
0.1% 溶液(0.1 M 酢酸) 筋細胞、肝細胞、脊髄神経節、胚肺
(三次元培養には適していません)
細胞、schwann細胞、その他多数の
細胞に使用されています
フィルター滅菌済み
三次元ゲル作成に適しています。
0.3%溶液
コラーゲン:10xPBS(または10x培地)
=8:1
(0.01 M HCl, pH 約2.0)
C9301
粉末
軟骨細胞
コラーゲン TYPE IV EHS肉腫由来
C0543
粉末
コラーゲン TYPE IV ヒト胎盤由来
C5533
凍結乾燥品
上皮細胞(内皮)、筋細胞、神経
細胞
コンドロイチン硫酸A ナトリウム塩
ウシ気管由来
C9819
凍結乾燥品
ECM (細胞外マトリクスゲル)
由来
EHSマウス肉腫
E1270
推奨使用濃度
軟骨細胞, 神経細胞, および一部の
腫瘍細胞に対する調節作用が示唆さ
れています
6-10μg/cm2
6-10μg/cm2
20-2000 μg/cm2
6-10 μg/cm2
8-12 mg/mL 溶液
フィブロネクチン
ヒト血漿由来
F0895
0.1% 溶液
(0.05 M TBS)
1-5 μg/cm2
または 0.5-50 μg/mL
フィブロネクチン
ウシ血漿由来
F1141
フィルター滅菌済み
1mg/mL溶液(TBS溶液)
1-5 μg/cm2
F3542
凍結乾燥品
F4759
粉末
フィブロネクチン フラグメントIII1-C
フィブロネクチン
リコンビナント
ウシ血漿由来
上皮細胞, 内皮細胞, 筋肉細胞,
神経細胞, 腫瘍細胞
0.5 μg/mLのフィブロネクチンに対し0.45
μg/mL FF III1-C
1~5 μg/cm2または
0.5~50 μg/mL
フィブロネクチン
ヒト血漿由来
F2006
凍結乾燥品
フィブロネクチン
ラット血漿由来
F0635
粉末
1-5 μg/cm2または
0.5-50 μg/mL
フィブロネクチン
ヒト包皮線維芽細胞由来
F2518
凍結乾燥品
1-5 μg/cm2または
0.5-50 μg/mL
フィブロネクチン様高分子タンパク
リコンビナント
F5022
1-5 μg/cm2
-
2-10 μg/cm2
ゼラチン
ウシ皮膚組織由来
G1393
2%水溶液
0.1-0.2 mg/cm2
ゼラチン
ウシ皮膚組織由来
G9391
粉末
0.1-0.2 mg/cm2
または5-10 μL/cm2
ゼラチン
ブタ皮膚由来
G1890
粉末
ゼラチン(γ線滅菌済み)
ブタ皮膚由来
G9136
粉末
上皮細胞、内皮細胞、神経細胞、筋
細胞、​肝細胞
上皮細胞, 内皮細胞, 筋細胞, 腫瘍
細胞, 肝細胞, シュワン細胞腫
ラミニン
EHS肉腫由来
L2020
1 mg/mL溶液
(TBS溶液)
ラミニン
ヒト胎盤由来
L6274
0.5 mg/mL溶液
(TBS溶液)
SPARC(オステオネクチン)
マウス卵黄嚢壁(PYS-2)細胞由来
S5174
凍結乾燥品
スーパー フィブロネクチン
S5171
2 mg protein/mL溶液
(TBS溶液)
ビトロネクチン
ヒト血漿由来
ヒト リコンビナント
SRP3186
凍結乾燥品
ビトロネクチン
ヒト血漿由来
V8379
凍結乾燥品
ビトロネクチン
ラット血漿由来
V0132
凍結乾燥品
ビトロネクチン
ウシ血漿由来
V9881
凍結乾燥品
=お奨め製品
各種細胞
様々な組織で発現され、in vitroで
細胞の伸展を阻害し接着点の数を減
少させます
上皮細胞, 間葉細胞, 神経細胞,
線維芽細胞, 神経堤細胞, 内皮細
胞
0.1-0.2 mg/cm2
または5-10 μL/cm2
0.1-0.2 mg/cm2
または5-10 μL/cm2
1-2 μg/cm2
1-2 μg/cm2
4-40 μg/cm2
1 μg/cm2
ビトロネクチンと結合する
インテグリン受容体を有する​細胞:
血小板、内皮細胞、メラノ-マ細胞、
骨肉腫など
0.1 μg/cm2
0.1 μg/cm2
0.1 μg/cm2
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製品の技術的なご質問 [email protected]
価格・在庫のご質問 [email protected]
2013.07
じっけんレシピ
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コラーゲンtype I でのコーティング方法
1. コラーゲンを0.1M酢酸中に加え、終濃度0.1%(W/V)のコラーゲン溶液を調整します。溶解するまで
室温で1-3時間ぐらいスターラーで撹拌します。コラーゲン溶液(C8919 )は1:10に希釈し0.01%
の濃度に調整して使用します。
2. 溶解したコラーゲン溶液はコーティングに用いる前に以下の処理を行うことを推奨します。コラーゲン溶液を
スクリューキャップのついたガラス遠心管に移し、クロロホルムを遠心管のそこに注意深く注入して重層させま
す。使用するクロロホルムの量は、コラーゲン溶液の約10%程度の体積にします。振盪、撹拌は行わない
ようにしてください。低温化に一晩静置した後、上層のコラーゲン溶液を無菌的に回収します。メンブレン
フィルターによるコラーゲン溶液の濾過滅菌はタンパクのロスが生じる可能性がありますのでお勧めできません。
3. 6-10㎍/㎠で培養ディッシュをコートします。室温または37℃で数時間、もしくは2-8℃で一晩プレートを
静置しタンパクを結合させます。
4. コートしたディッシュ表面から余分な液を除き、一晩放置して風乾します。未滅菌のコラーゲン溶液を使用
した場合はコートおよび乾燥を行ったディッシュ表面をクリーンベンチ内で紫外線を一晩照射することによって
容易に滅菌できます。
5. 細胞と培地を加える前に組織培養グレードの滅菌水、または平衡塩溶液を用いて表面をよくすすぎます。
(注意)コラーゲン溶液(製品番号:C8919)の場合には2)のステップは不要です。
コラーゲンTypeII、及びType IVでのコーティング方法
1. TypeII, VIは0.25%酢酸を添加して0.5-2.0㎎/mlの濃度に溶解、調整します。時々バイアルを軽く
回しながら2-8℃で数時間かけ溶解してください。
2. 培養用プラスティックディッシュのコートは上記のコラーゲン溶液を塗布して風乾させて使用します。風乾させ
ない場合は溶液を塗布した後2-8℃で一晩放置してコートしてください。
3. コートおよび乾燥させたディッシュはクリーンベンチ中で紫外線を表面に一晩照射して滅菌するか、70%エ
タノールで洗浄して滅菌する事ができます。別の方法としてはコラーゲン溶液を0.25%酢酸―0.5%クロロ
ホルム溶液に透析して滅菌することも可能です。
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2013.07
じっけんレシピ
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3次元コラーゲンゲル作成方法
Type I コラーゲンは3次元培養用のマトリックスとして広く利用されています。本プロトコールは一般的な3次元
培養用のマトリクス作成法をご紹介します。弊社ではコラーゲンは3次元培養用の試験を行っていないため、ロッ
ト間差によっては3次元ゲルの形成に適切でない場合もございます。
必要な試薬
コラーゲンゲル溶液(1.5-3㎎/ml)※
フェノールレッド含有培地(10X)
重炭酸ナトリウムもしくはHEPESバッファー
※コラーゲンゲル溶液調整法参照
コラーゲンを0.1M酢酸中に加え、コラーゲン溶液を調整します。溶解するまで室温で1-3時間ぐらいスターラー
で撹拌します。
クロロホルムでの滅菌は推奨しません。抗生物質や抗真菌剤(製品番号:A5955 など)の添加が効果的
の場合があります。
手順
1. 800μlのコラーゲン溶液を滅菌チューブにピペットで移します。
2. 100μlの10倍濃縮培地を加えます。
3. 1N水酸化ナトリウム溶液を加え(100㎕もしくはそれ以下)、pHを中性にします。
4. よく混合してください。液がフェノールレッドにより赤くなれば生理的なpHです。
5. ウェルに無菌的に分注してください。液量の深さは底から1-2mmとしてください(24ウェルプレートの場合、
液量は約15㎕)。
6. 37℃のインキュベーターで20-40分程インキュベートします。
7. ゲルの形成を確認してください。
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2013.07
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ゼラチン2%溶液(G1393)
細胞付着の至適条件は各細胞株・実験条件により異なります。
1. 37℃に加温してゼラチン溶液を完全に融解します。
2. 培養容器の表面を5~10μl/Cm2のゼラチン溶液でコーティングします(これは0.1~0.2mg/cm2のゼラ
チンに相当します)。
3. 細胞と培地を加える前に室温で少なくとも45分間風乾します。
ゼラチン(G9391、G1890、G9136)
細胞付着の至適条件は各細胞株・実験条件により異なります。
1. ゼラチンを細胞培養グレードの水に溶解して2%(W/V)溶液を調整します。
2. 121℃、15psiで30分間オートクレーブします。
3. 培養容器表面を5-10μl/cm2のゼラチン溶液でコーティングします。
4. 細胞と培地を加える前に室温で少なくとも45分間風乾します。
ラミニン(L2020、L6274)
細胞付着の至適条件は各細胞株・実験条件により異なります。
1. ラミニンをゲル化しないように2-8℃で徐々に融解します。
2. 平衡塩溶液中に希釈して培養容器の表面を最低限の量でコートします。
3. 細胞と培地を加える前に室温で少なくとも45分間風乾します。
ポリリジン(P7280、P6407、P7405、P9155、P6282、P5899、P4707、
P4832)
ポリ-リシンは細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の接着因子が持つ表面陽イオンとの間の相互作用
を促進します。 細胞によってPoly-L-lysineを消化してしまうものがあるので、その場合にはPoly-D-lysineを
使用します。
分子量と粘度は比例しており分子量小さいと粘度が低いため扱い易く、分子量が大きいと粘度が高いの
で取り扱いは難しいですが、密度を高くすることができます。細胞付着の至適条件は各細胞株・実験条件
により異なります。
1. 細胞培養グレードの滅菌水50mlをポリリジン5mgに添加します。
2. 培養容器の表面を1.0ml/25cm2の溶液で無菌的にコートします。均一にコートできるように静かにゆすって
ください。
3. 5分後に溶液を完全除去し組織培養グレードの滅菌水を用いて表面を完全にすすぎます。
4. 細胞と培地を加える前に室温で少なくとも2時間風乾します。
注:P4717とP4832を使用する場合には1のステップは不要です。
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2013.07
じっけんレシピ
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トロンボスポンジン
細胞付着の至適条件は各細胞株・実験条件により異なります。
1. 組織培養グレードの水0.5mlで溶解・復元し濾過滅菌をします。
2. 濾過後の溶液はうっすらと濁ったように見え、終濃度40μg/mlにします。
3. 培地中のトロンボスポンジン濃度は25ng~50μg/mlでの範囲での濃度が論文などで報告されています。
具体的な使用方法は各文献をご参照ください。
ビトロネクチン(V8379、V0132、V9881)
1. 組織培養グレードの水で溶解・復元し濾過滅菌します。
2. 本物質は培養表面の濃度が0.1μg/cm2の時に活性を示すことが文献により報告されています。尚、至
適条件は細胞によって異なります。
3. 培養容器の表面を37℃で1-2時間コートします。残った溶液は完全に取り除き、細胞と培地を加える前
に平衡塩溶液で洗浄します。
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2013.07
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培養容器コーティング方法 - Sigma