マウス2細胞期胚のEFS溶液を用いたガラス化法による凍結保存の手順
*使用する器具類*
実体顕微鏡、タイマー、
胚操作用ピペット(内径120-150mm)、
クライオチューブ(NUNC#366656)、
ピペッター(100または200ml用)、
培養用ディッシュ(35mm)、ピンセット、
液体窒素取り扱い用グローブ、フェイスマスク。
*使用する試薬*
EFS20(平衡液)およびEFS40(ガラス化液 )。
<注意:直前にそれぞれをよく混和してください。>
調整の仕方:
30% w/v Ficoll 70 + 0.5M sucrose-PB1で
ethylene glycol を20%および40%に希釈。
*凍結手順:操作はすべて室温(23±2℃)で行います*
図1
EFS40を
50ml 入れる
図2
EFS20の小滴
(50ml )
ピペッターでEFS40を50ml クライオチューブに入れます。
EFS20の小滴(50μl)を2つ、ディッシュのフタなどに
載せておきます。
図3
凍結する胚をなるべく少量の培養液と共に(胚操作用ピペットの先を
底に近づけて)、EFS20の小滴へ移します。
ピペット操作のコツ
図4
約1分後、空にした胚操作用ピペットで
EFS20をピペットの細い部分の
半分まで吸います。
EFS20を吸った状態
2分間
図5
胚を吸い取った後
胚は表面に浮いているので、
実体顕微鏡で胚が収縮
しているのを確認しなが
ら、なるべく少量の
EFS20と共に吸い取り
ます。
胚をチューブに移した後
図6
胚をEFS20に浸してから2分後に、チューブ内
のEFS40の中へ胚を移します。
1分間
図7
更に1分後、チューブを液体窒素へ浸けて
凍結させます。
そのまま、液体窒素タンク内にて、チューブが
液体窒素に浸かっている状態で保存を
行います。
注意点:多量の培養液を胚と共にEFS20へ移すと平衡化がうまくいかない場合があります。
ピペットの内径を細くするなど培養液をなるべく持ち込まないように操作を行ってください。
EFS20の中で胚が収縮しない場合は注意が必要です。
EFS溶液を用いてガラス化凍結保存したマウス胚の融解・回収手順
*使用する器具類*
*使用する試薬*
融解液1 (TS1) : 0.75 M sucrose – PB1 (37℃で使用)。
融解液2 (TS2) : 0.25 M sucrose – PB1 (室温で使用)。
培養液 (M16) :予め5%CO2インキュベータ内、37℃で平衡させておく。
図1
実体顕微鏡、タイマー、胚操作用ピペット、ピンセット、
ピペッター(1,000ml用および100または200ml用)、
培養用ディッシュ(35mm)、
培養用ディッシュ(50mm)のフタまたは時計皿など、
液体窒素取り扱い用グローブ、フェイスマスク。
シリコンオイルまたは
ミネラルオイル
*融解・回収手順*
TS1のチューブを予め37℃に温めておきます。
M16培養液の小滴(10ml)
凍結胚融解後の培養用ディッシュ(35mm)を準備します。
図2
液体窒素中から
チューブを取り出す
フェイスマスク、グローブをつけ、液体窒素の中から
凍結チューブを取り出します。
図3
液体窒素を捨て、
30秒間静置
フタを開けて内部の液体窒素を捨て、机に立ててそのまま
30秒間、静置します。
図4
TS1 (37℃)を
800ml 入れる
TS1 (37℃) 800 ml をチューブの中に入れます。
ピペッティングで10-12回(20-25秒間)ゆっくりと出し入れをしながら
ガラス化溶液が融けるまで混ぜ合わせます。
溶けるまでピペッ
ティングを行う
(20-25秒)
静かにピペッティング操作を行うと気泡ができにくいので、
胚の回収が容易です。
図5
ディッシュの
フタへ
溶液を移す
融けたら速やかに全溶液を50mmディッシュのフタ(時計皿など)へ
ピペッターで移し、タイマーで3分間計測開始します。
図6
ディッシュのフタを軽く揺らして溶液を広げます。
揺らして溶
液を広げる
(胚のピックアップが容易になります)
3分間
図7
TS2 の小滴
( 50ml )を
載せる
ディッシュに、TS2の小滴(50ml)を3つ載せます。
図8
融解から3分後、
TS2の小滴へ
胚を移す
融解から3分後に、TS1の中の胚を胚操作用ピペットで回収し、
TS2の小滴へ移します。
タイマーで3分間計測開始
回収の際、胚は表面に浮いていることもあり、
ディッシュを軽く揺らすと見つけやすくなります。
3分間
図9
TS2へ胚を移して3分後に、残り2つの小滴で胚を洗浄して
から、培養用ディッシュの培養液中に胚を移します。
3分後、TS2の
小滴に2回 胚
を移す
移植までインキュベーター内で培養します。
図10
融解直後の胚は浸透圧変化に敏感なので、
必ずM16培養液を用いてください。
M16培養液中で
移植まで培養
胚移植は、当日膣栓を確認した偽妊娠雌の
卵管内へ、融解した日に行ってください。
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