Accumulation Timer
iGEM Chiba 2008
入力班:小林あおい、香取崇広
送受信班:川崎浩平、冨永将大、井山佳美
出力班:福冨浩樹、杉山まい
Accumulation Timerの作成
・ 放射線、紫外線、毒性物質….
一過性であり、被爆量(量×時間)に依存する汚染
↓
バクテリアによる環境汚染計測
・従来型センサ;入力強度センサ
・我々のセンサ;累積計
時間軸の付加
タイマーの作成
Quorum Sensing
 Sender→Receiver;化学分子の送信
仮説:十分量の分子が溜まらないと、Receiverは感知しない
本研究のポイント
話し手(Sender)と聞き手(Receiver)の通信感度を適正化
→さまざまな時間タイマーの作成
システム内容
UV
Accumulation Timerの条件
①前回の出力が打ち消されない
Accumulated effect
Off時でも前回の
onの記録を保存
To our body
Input Value
Signal conc.
Accumulation Timerの条件
②on時の出力は一定
③on/offの区切りしっ
かり
Time
off
on
Time
④一定時間を超えた
ことを提示する
入力チーム
小林あおい・香取崇広
SOS Response
入力
Sensor
入力として設定したいもの ・・・
「一過性の情報」
・ 可視光(難)
・ 紫外線
UVに曝露された時間を計る!
・ 温度(細胞の成育状況に影響)
UV Sensor(PrecA)
RecA
LexA
LexA
OFF
UV
RecA
LexA
LexA
UV
ssDNA
ON
BBa_J22136を用いたUV照射実験
16W
2.5cm
7.5cm
254nm
? J/m2
Irradiation Time
RFP発現観察
After Irradiation
0
0
30sec
30min
1h
×
×
×
×
1h
×
×
×
×
12h
×
×
×
×
24h
×
×
×
×
PrecAの懸案事項
・ leakyである ・・・XL10G(recA-), 48hでRFP発現
・ UVによるswitch on 難.
Sub Cloning中
UV Sensor(PcI)
RecA
cI
cI
OFF
UV
RecA
UV
cI cI
ssDNA
ON
UV によるDeath Curve作成
<BW⊿tdk (RecA+)>
3 ml LB medium
<UV Source>
7.5 cm
UVGL-58 Mineralight Lamp
(multiband UV-254/366 nm; San Gabriel, CA)
100V, 0.16A
UVによるDeath Curve作成
105希釈
CFU
104希釈
-UV 105希釈
0
10 30 1h
min min
2h
4h
6h
8h
Irradiation Time
入力をUVにすることの懸案事項
・ 2hで大腸菌全滅 ・・・ 2h以上のタイマー不可.
・ AHLがUVで分解される!?・・・ NOW GOING
O
O
HN
O
O
Ex. 3OC6HSL
モデルとしてアラビノースプロモーターを用意する.
送受信チーム
冨永将大・川崎浩平・井山佳美
SOS Response
全体像
AHL
送受信システムの作成
目標:1hでは光らないが
一定時間ONが続くと光る
通常AHL通信
1 hour
Receiver(AHL感受性)変更通信
Still inactive
ON
OFF
4 hours…
1 hour
ON
ON
Still inactive
求められること
AHL
5 hours…
①AHL合成量
(合成速度)を下げる
→RBSの調整
②感受性を下げる
→シグナル
分子の変更
シグナル伝達:Quorum sensing
AHL
基本構造
Autoinducer
synthase
Recepter
Protein
由来生物
V.Fisheri
luxI(OHHL)
LuxI
LuxR
LasI(OdDHL)
P.aeruginosa
lasI
lasR
R.leguminosarum
cinI
cinI
cinR
RhlI(BHL)
P.aeruginosa
RhlI
RhlR
シグナル分子(=AHL)の変更
《Cross talkを利用した実験》
Autoinducer synthase
Recepter Protein
LuxI
LuxR
lasI
lasR
cinI
cinR
RhlI
RhlR
実験の流れ
テスト準備(8/17~)
バラバラなパーツの組み直し
CrossTalkテスト(9/2~)
Lux
Las
Rhl
Cin
Lux
Las
Rhl
Cin
タイムディレイテスト(9/8~)
Today
今週の成果1 : パーツ合成
Biobrickから新たなパーツを合成
Plac
Plac+RBS
RhlI
Ligation
RBS + CinI+LVA, RhlI+LVA
RhlI, CinI
RhlI+LVA
CinI+LVA
LasI
今週の成果2 : Cross-talkの確認
Autoinducer synthase
RhlI
Recepter Protein
LuxR
RhlI+LVA
cinI+LVA
LasI
未実施:
LuxI, luxI+LVA,
CinI, LasI+LVA
Cross-talkテスト1
Sender
Receiver = LuxR
80
70
蛍光強度 [-]
60
50
40
30
20
10
0
LuxI
LasI
RhlI
図1. Cross-Talk Test 1
8H (Sender:Receiver=1:1) 8H:Spindown→12H
AHL
N.C.
Cross-talkテスト2
Sender
Receiver = LuxR
100
90
80
蛍光強度 [-]
70
60
50
40
30
20
10
0
LuxI
CinI+LVA
RhlI+LVA
図2. Cross-Talk Test 2
5H (Sender:Receiver=1:1) 5H TM
AHL
N.C.
タイムディレイテスト
Sender : Lux, Las, Cin, Rhl
Reciever : Lux
LuxI
LasI
RhlI
Sender : Receiver
1:1
時間 / hour
一定時間ごとに蛍光強度測定
CinI
今後の予定
1、タイムディレイテスト
2、遺伝子発現数の制御
→プラスミドベクターの変更
3、転写量の制御
→RBSの交換
出力チーム
福冨浩樹・杉山まい
SOS Response
どのような出力が必要?
出力となるタンパクの発現から、発色などを確認できるまでの時間が短い出力
出力
蛍光タンパク質
Luciferase
出力
見える?
?
スイッチング
?
時間(※)
~
※時間は固体培地上で目視で来るまでの時間
?
LacZ
Response Test
wash
Pick
Glucose 0.2%
Glucose 0.2%
コロニーリフト
M9, IPTG 0.1mM
(X-Gal 80μg/mL)
UVで励起して観察
IPTG 0.1mM
(X-Gal 20μg/mL)
テスト結果
GFPuv
Venus
LacZ
mcherry
0min
X
X
X
X
30min
X
X
X
X
1hour
X
X
X
X
1.5hour
○
X
X
X
2hour
○
○
○
○
2.5hour
○
○
○
○
3hour
○
○
○
○
3.5hour
○
○
○
○
GFPuvが最も早く発現
Note:蛍光たんぱく
• GFPuvが最も早く発現しているように見えた
– 適切な励起光で励起していたために早かった?
• VenusやmCherryも適切な励起光であれば、さ
らに早く観察されることが考えられる
Note:LacZ
• LacZ-Xgalの出力までが遅いのはXgal濃度が
低いため?
– Xgal 20μg/mLを40μg/mL,80μg/mLにしてレスポン
スタイム計測
80mM ○
IPTG なし
40mM ○
3hour
20mM
40mM
80mM
0min
X
X
X
1hour
X
X
X
2hour
X
X
○
3hour
X
○
○
4hour
○
○
○
Note:Luciferase
• Renilla Luciferaseの反応:ルシフェリンの酸化
Renilla
Luciferase
λ=480nM
Coelenterazine
• Coelenterazine:膜透過性がある
β-Cyclodextrinを加えると10倍水に溶ける
β-Cyclodextrin
まとめ
• 現在一番早いもの・・・GFPuv (発色まで1.5h)
• LacZやLuciferaseは基質濃度に左右される
– 基質濃度を上げることで1.5hより早く発色することは考え
られる。
To Do
• Luciferaseのタイムレスポンスの比較
ルシフェリンの濃度を上げて実験
いつ終わるのか?
• UVを入力とする場合、UVに耐えられる安定な
出力が求められる
– ある程度候補を挙げたらUVに対する安定性を調
べたい。
• 来週までには大まかな結果を出し、採用する
出力を決定したい。
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UV - iGEM 2008